肝泰煎劑含藥血清誘導人肝癌細胞系Bel-7402細胞的凋亡*

李東濤 阿古拉 張 紅 王 劍

中國人民解放軍濟南軍區青島第一療養院第二療養區中醫綜合科 (山東青島，266071)

肝泰煎劑 (GTJJ)是我們在臨床上治療原發性肝癌的主方。具有益氣疏肝、活血軟堅、解毒抗癌作用，臨床應用顯示，該方有抑制腫瘤生長及延長患者生存期的作用。為了深入研究其作用機制，我們設計了體外培養細胞的血清藥理學實驗，結果如下。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭大白兔12只，雌性，體重2.45～2.7kg，購于中國藥品及生物制品檢定所。對數生長期的Bel-7402細胞，由中國中醫研究院廣安門醫院提供。GTJJ藥物組成：柴胡、白芍、白術、云苓、水紅花子、黃芪、鱉甲、藤梨根、冬凌草、干蟾皮、白花蛇舌草等，常規水提取，生藥濃度3.4kg/L，4℃保存備用。GTJJ含藥血清的制備：健康新西蘭大耳白兔12只，隨機分為NS(生理鹽水)、GTJJ等效劑量(GTJJD，約為人用量的5倍)、GTJJ高劑量 (GTJJG，約為人用量的10倍)3組，每組4只，8∶00、14∶00時各給藥1次。NS組兔灌喂10ml的生理鹽水，后兩組兔用中藥每只每次稀釋成10ml灌喂，重復給藥5次，末次給藥前12小時禁食不禁水，末次給藥后1～1.5小時之內分別從耳中央動脈無菌采血10ml，室溫靜置2小時，冷凍離心機1 500r/min離心10分鐘，吸取血清，56℃ 30分鐘滅活，22μm針式微孔濾膜過濾，-20℃冰箱保存備用。順氯氨鉑 (DDP)：山東齊魯制藥廠產品。RPMI1640完全培養液：RPMI培養干粉 (GIBCO)內含2mmol/L谷氨酰胺、青霉素100ku/L、鏈霉素100mg/L，應用時加入100ml/L滅活的小牛血清。四甲基偶氮唑鹽 (MTT)、碘化丙啶 (PI)、RNAA酶、吖啶橙 (AO)：美國Sigma公司產品。AnnexinV-FITC試劑盒：北京寶賽生物技術有限公司生產。全自動酶標儀 (Microplate AUTO Reader)EL311：美國BioTek公司產品。BH2-RFC落射式熒光顯微鏡：Olympus公司產品。激光共聚焦掃描顯微鏡 (Radiance2000)：美國Bio-Rad公司產品。FACSort流式細胞儀 (FCM)：美國Becton-Dicknson公司生產。

1.2 方法

1.2.1 GTJJ含藥血清對人肝癌細胞系Bel-7402生長抑制作用處于對數生長期的人肝癌細胞Bel-7402經2.5g/L胰酶消化后，接種于96孔板中，每孔100μl(1×108/L)，孵育24小時，分組為NSD(生理鹽水低濃度)、NSG(生理鹽水高濃度)、GTJJDD(GTJJ等效劑量低濃度)、GTJJDG(GTJJ等效劑量高濃度)、GTJJGD(GTJJ高劑量低濃度)、GTJJGG(GTJJ高劑量高濃度)、DDP 7組;分別加入生理鹽水兔血清至終濃度為100ml/L、200ml/L，GTJJ等效劑量兔血清至終濃度為 100ml/L、200ml/L，GTJJ高劑量兔血清至終濃度為100ml/L、200ml/L，DDP 2 mg/L。另設對照組為含培養細胞的培養孔單純加入培養液100μl、空白組為不含培養細胞的空白孔單獨加培養液。每組復孔為6個，置于37℃，50ml/L濕化的CO2培養箱中孵育。72小時后，沿培養孔邊緣輕輕吸出上清100μl，加入MTT儲液10μl(5g/L)，繼續培養4小時，加入二甲基亞砜 (DMSO)100μl，震蕩器輕微震蕩后，用EL311型全自動酶標儀測其A值，測定波長570nm，參考波長630nm，計算對細胞的抑制率 (%) =［(對照組平均A值-空白組平均A值) -(藥物平均A值-空白組平均A值)］÷ (對照組的平均A值-空白組平均A值) ×100%。

1.2.2 影像學觀察方法［1，2］處于對數生長期的人肝癌細胞Bel-7402細胞，經2.5g/L胰酶消化后，分瓶，傳代細胞處于對數生長期時分組為NSD、NSD+DDP、GTJJDD、GTJJDD+DDP、GTJJGD、GTJJGD+DDP 6組，加中藥血清同1.2.1。加DDP各組DDP終濃度為4.5mg/L。50ml/L濕化的 CO2培養箱中孵育。PBS液離心洗滌1次，取少量細胞涂片，速入950ml/L冷乙醇固定10～15分鐘，稍干;10g/L醋酸酸化30秒，0.1g/L AO染色8分鐘;PBS液 (pH4.8) 洗滌1分鐘后，0.01mol/L CaCl2分化 2分鐘，再入 3個含 PBS液(pH4.8)的染色缸洗3次，每次數秒;PBS液臨時封固，置熒光顯微鏡觀察，藍光激發，照相。另染色方法同AO染色，置激光共聚焦掃描顯微鏡觀察［3］，藍光激發 (B，488nm)，阻擋濾片530/30Bp、630/30Bp，發射波長515nm(DNA，綠光)、630nm(RNA，紅光);采用該儀器的雙染色樣品掃描分析軟件分析，照相。

1.2.3 GTJJ含藥血清對人肝癌細胞系Bel-7402細胞周期的影響及誘導凋亡［4］傳代細胞處于對數生長期時分組為NSD、NSG、GTJJDD、GTJJDG、GTJJGD、GTJJGG 6組。

PI染色：加中藥血清同1.2.1。分別于孵育12、24、48、72小時時處理細胞。0.1mol/L PBS液離心洗滌 (1 000r/min，5分鐘)兩次后，加入700ml/L冷乙醇4ml，4℃固定24小時。檢測前棄去乙醇，PBS液離心洗滌兩次，加入RNAA酶(20mg/L)及PI(50mg/L)混合染液1ml，4℃避光染色30分鐘。350目尼龍篩網過濾，調整瘤細胞濃度1×108/L，FCM檢測，計算出DNA含量，得出細胞周期 (G0/G1，S，G2+M)的百分比和凋亡細胞的比例。

AnnexinV-PI雙染：處理細胞同1.2.2，于孵育24小時時處理細胞。將培養液倒入5ml離心管，加入2.5g/L的胰酶消化，加入原培養液，混合后，1 000r/min 4℃離心10分鐘，棄上清，加入冷PBS 1ml，輕輕震蕩使細胞懸浮，1 000r/min 4℃離心10分鐘，棄上清，重復上述步驟兩次。將細胞重懸于 200μl Binding Buffer。加入 AnnexinV-FITC 10μl和 PI 5μl，輕輕混勻，避光室溫反應15分鐘或4℃反應30分鐘。加入Binding Buffer 300μl，立即流式細胞儀分析。

2 結果

2.1 GTJJ含藥血清對人肝癌細胞系Bel-7402的生長抑制作用見表1。

表1 MTT法測定GTJJ含藥血清對人肝癌細胞系Bel-7402體外生長抑制

GTJJ含藥血清均有不同程度抑制腫瘤生長作用，以20%GTJJ高劑量組含藥血清作用顯著，為50.09%，與NSD、NSG組比較，差異有顯著性意義 (P＜0.01)，但與化療藥物DDP相比，各組還有一定差距。

2.2 影像學觀察結果 熒光顯微鏡下AO染色 除NSD、NSG組外，各用藥組均可發現明顯的凋亡細胞，核染色質濃縮，早期染色質聚集于核周邊部而呈新月形，晚期細胞核濃縮，并碎裂成大小不等的片段，晚期凋亡細胞進一步碎裂形成由質膜包繞的含有多少不等的核碎片的凋亡小體，細胞的細胞核染色質形成明亮的凝聚塊，以各加DDP組最為明顯。單純加中藥GTJJ各濃度組也顯示有明顯的細胞凋亡 (見插頁圖1)。激光共聚焦掃描顯微鏡下細胞的形態變化NSD、NSG組細胞大小相對均勻，為圓形，無缺損或破壞，DNA熒光強度分布地形圖顯示細胞分布茂密，整個結構形態充滿，自核邊緣至核中央熒光強度逐次遞強，完整無損。各加藥組細胞形態不規則，熒光強度分布不均，大面積出現熒光強度減低，各組均能發現細胞凋亡表現，單純中藥組以GTJJGD最為明顯(見插頁圖2)。

2.3 GTJJ含藥血清對人肝癌細胞系Bel-7402細胞周期影響及凋亡誘導 PI染色：在12小時點上，與NSD、NSG組相比，各加藥組出現G0/G1期阻滯，以GTJJDD最為明顯，未出現細胞凋亡現象。在24小時點上，各中藥組均出現不同程度的細胞凋亡現象，并出現明顯G0/G1期阻滯。在48小時點上，各加藥組凋亡細胞數量增加，以GTJJDD最高，為16.2%，在72小時點上，凋亡細胞數量明顯減少，但仍有G0/G1阻滯現象，由于此時出現細胞饑餓現象，NSD開始出現部分細胞凋亡 (表2，圖3)。

表2 含藥血清對Bel-7402細胞周期的影響及細胞凋亡的誘導情況

AnnexinV-PI雙染：GTJJDD及GTJJGD組24小時點早期凋亡率并不高，但中晚期凋亡數量較高，因此凋亡總數比NSD組高，差異有顯著性意義 (P＜0.001)。另外，中藥加DDP比單純用DDP(即NSD+DDP組)凋亡總數明顯增高，差異有顯著性意義 (P＜0.001)，顯示中藥與DDP的協同作用 (表3，圖4)。

圖3 PI染色FCM測定GTJJDD組含藥血清48h時段對Bel-7402細胞周期影響及細胞凋亡的誘導情況

表3 GTJJ含藥血清24小時時段對Bel-7402細胞凋亡的誘導情況

圖4 AnnexinV-PI染色測定GTJJGD+DDP組含藥血清24h時段對人肝癌細胞系Bel-7402早期凋亡誘導

3 討論

細胞凋亡是中藥抗癌的主要作用機制之一。針對肝癌而言，許多中藥顯示較好的誘導肝癌細胞凋亡作用。如浦洪琴等［5］證實中藥抗癌靈具有誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡的作用，其分子機制可能與上調caspase-3和下調survivin基因表達有關。朱麗紅等［6］研究發現，吳茱萸堿能抑制人肝癌細胞HepG2的生長及誘導其凋亡。李伯利等［7］研究發現，冬凌草甲素能夠明顯抑制HepG2細胞增殖，并誘導肝癌細胞凋亡，其作用途徑可能與上調PTEN mRNA表達有關。宋超等［8］研究發現，黃芩素能抑制HepG2細胞的增殖，促進其凋亡，其機制可能與miR-34a上調有關。以上說明許多中藥通過誘導細胞凋亡而產生抑制腫瘤效果。我們測定GTJJ含藥血清對人肝癌細胞系Bel-7402體外生長抑制作用，結果顯示，肝泰煎劑有一定抑制肝癌細胞生長效果。熒光顯微鏡下AO染色，各用藥組均可發現明顯的凋亡細胞，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示，各組均能發現細胞凋亡現象。因此，我們認為，GTJJ含藥血清有誘導肝癌細胞凋亡作用。

引起細胞凋亡典型形態學變化的機制在于Ca2+、Mg2+依賴性核酸內切酶的激活導致染色質DNA在核小體連接部位斷裂，形成以180～200bp為最小單位的單體或寡聚體片段。流式細胞儀PI染色法可以檢測DNA降解，在正常的G0/G1峰之前出現的一亞二倍體峰為凋亡峰。我們通過PI染色法流式細胞學檢查結果顯示，GTJJ含藥血清在藥物作用24小時后，能出現明顯的凋亡峰。但凋亡細胞數量較少，GTJJDG組細胞凋亡率為1.7%，但48小時后，GTJJDD為16.2%。

在各種細胞受到誘導后產生凋亡的初期，均會出現膜內外層面磷酯酰絲氨酸 (PS)重新分布，即膜內表面的PS發生不可逆轉的外露，且明顯早于核內DNA固縮、變性、裂解［9］，檢測外表面的PS，可了解凋亡的早期狀況。AnnexinⅤ與PS有較強的親和力，具有鈣依賴性。由于壞死細胞的PS也有外露現象［10］，因此，AnnexinV和能夠進入破損細胞膜內與降解DNA結合的PI法聯合應用才可以區分凋亡和壞死［11，12］。我們采用AnnexinⅤ/PI法雙染色觀察了用藥24小時后早、中、晚期凋亡細胞分布，結果顯示，GTJJ中藥組在早、中、晚期均有誘導細胞凋亡作用，但與DDP相比，凋亡細胞數量相對較少，其中GTJJGD凋亡細胞數量為7.33%，說明中藥誘導肝癌細胞凋亡比較和緩。以上說明，誘導肝癌細胞凋亡是肝泰煎劑抑制肝癌細胞生長的重要作用機制。

肝泰煎劑主要有柴胡、白芍、白術、云苓、水紅花子、黃芪、炮山甲、鱉甲、藤梨根、冬凌草、干蟾皮、白花蛇舌草等藥物組成，具有疏肝理氣、益氣健脾、活血軟堅、解毒抗癌等功效，臨床上應用本方為主治療肝癌，取得較好療效。現代研究證實：柴胡皂甙d與黃芪總黃酮皆能誘導K562細胞凋亡［13，14］;白芍總苷在體外能夠抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，并能誘導細胞凋亡［15］;藤梨根提取物誘導胃癌細胞凋亡［16］;不同濃度的微米冬凌草甲素能夠誘導腫瘤細胞的caspase-3基因表達，引起細胞的凋亡，并呈劑量依賴性［17］;蟾皮提取液能誘導腎癌細胞凋亡，下調Fas及上調FasL和bcl-2表達［18］，白花蛇舌草可能通過誘導H22肝癌細胞移植瘤小鼠瘤組織HSP70表達，在一定程度上促進肝癌細胞凋亡而達到抗腫瘤的作用［19］。這些藥物雖然在方中的中醫配伍功效不同，但皆可誘導腫瘤凋亡，這也是中藥復方肝泰煎劑能夠有效地誘導肝癌細胞凋亡的基礎。

［1］潘耀謙，于艷，夏志平.檢測細胞凋亡的常用方法［J］.動物醫學進展，2001，22(2)：32-35.

［2］王莉，李健，張健，等.細胞凋亡機制與方法學研究進展［J］.解剖科學進展，2002，8(2)：170-174.

［3］劉暢，顧玲.激光掃描共聚焦顯微鏡在細胞凋亡研究中的應用［J］.醫學綜述，2001，7(10)：583-504.

［4］BENDERITTER M，VINCENT-GENOD L，BERROUD A，et al.Simultaneous analysis of radio-induced membrane alteration and cell viability by flow cytometry ［J］.Cytometry，2000，39(2)：151-157.

［5］浦洪琴，韋鵬涯，韋星，等.中藥抗癌靈誘導人肝癌SMMC7721細胞凋亡及其機制研究［J］.中國老年學雜志，2009，29(3)：288-290.

［6］朱麗紅，劉小東，譚宇蕙，等.吳茱萸堿對人肝癌細胞HepG2的生長抑制及誘導凋亡作用 ［J］.中國藥理學通報，2009，25(1)：68-71.

［7］李伯利，朱敏，王晨，等.冬凌草甲素上調人肝癌HepG2細胞PTEN基因表達與誘導凋亡作用 ［J］.醫藥導報，2008，27(9)：1038-1040.

［8］宋超，劉霞，邵啟祥，等.黃芩素對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響及miR-34a在其機制中的作用［J］.江蘇大學學報·醫學版，2011，21(6)：470-475.

［9］ZWAAL RF，SCHROIT AJ.Pathophysiologic Implications of Membrane Phospholipid Asymmetry in Blood Cell［J］.Blood.1997，89(4)：1121-1132.

［10］PENG L，LIU JJ.A novel method for quantitative analysis of apoptosis［J］.Lab Invest，1997，77(6)：547-555.

［11］胡慶柳，樸英杰，周美娟.一種檢測早期凋亡的細胞的方法［J］.細胞生物學雜志，2000，22(3)：155-157.

［12］彭黎明.用Annexin法定量分析淋巴瘤細胞凋亡與壞死［J］.中華醫學檢驗雜志，1999，22(1)：49.

［13］夏薇，崔新羽，陳靜波.柴胡皂甙d(SSd)對K562細胞凋亡及基因表達影響的研究 ［J］.中國現代醫學雜志，2002，12(10)：21-23.

［14］張冬青，汪德清，李卉，等.黃芪總黃酮對K562細胞凋亡及細胞周期的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(1)：136-137.

［15］王世宏，魏偉，許杜娟，等.白芍總苷對HepG2細胞增殖的抑制作用 ［J］.安徽醫科大學學報，2006，41(5)：547-549.

［16］衛培峰，焦晨莉，張三印.藤梨根提取物誘導胃癌細胞凋亡的實驗研究 ［J］.陜西中醫學院學報，2005，28(3)：52-53.

［17］王培軍，扈清云.微米冬凌草甲素對小鼠H22腫瘤細胞凋亡的實驗研究 ［J］.黑龍江醫藥科學，2010，33(1)：3-4.

［18］孫凌飛，中文江.蟾皮提取液對腎癌細胞凋亡及Fas，FasL和bcl-2表達的影響［J］.中國醫藥導刊，2000，2(5)：32-33.

［19］胡玲，羅曉韻，謝宇暉，等.白花蛇舌草誘導HSP70表達對H22肝癌細胞移植瘤細胞凋亡的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20(6)：536-539.