絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶31(STK31)基因在小鼠脊髓損傷后的差異表達*

程結南,李 平,程 躍,章文信,蔡亞非

(安徽師范大學生命科學學院,蕪湖 241000)

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,STK)是細胞中廣泛存在的一種化學酶,其家族包括很多成員,主要是通過特異地催化蛋白質的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化來參與細胞的增殖、分化、凋亡等生命活動。小鼠STK31基因位于第6號染色體上,其編碼產物含有1018個氨基酸。目前已發現STK31與癌癥及精子發生相關,而與脊髓損傷的關系還未見報道。本文旨在結合我們實驗室前期工作并通過分子手段來確定STK31與脊髓損傷的潛在關聯,為脊髓損傷研究提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 實驗動物為本實驗室繁殖的7～8周齡成年昆明小白鼠。隨機挑選50只健康小白鼠,分為空白對照組和脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)處理組,其中空白對照組(A組)為假損傷組,只切開椎板不進行損傷處理即縫合;SCI處理組被設置為5個小組(n=5):B(損傷后4 h)、C(損傷后8 h)、D(損傷后1 d)、E(損傷后3 d)、F(損傷后7 d)。

1.1.2 儀器及試劑 Ultrospec 4300紫外分光光度計為瑞士安法瑪西亞公司產品;ABI 7300 PCR擴增儀為美國應用生物系統(ABI)公司產品;RNA的提取及逆轉錄試劑購自上海生工;DNA擴增試劑及標準品購自廣州市達暉生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 制作脊髓損傷模型 使用Nystrom法構建脊髓損傷模型。腹腔注射5%的水合氯醛麻醉小鼠,使其俯臥在實驗手術臺上并固定,沿著T8中線切開背部皮膚及附著組織,除去錐板,小心暴露脊髓,并用重物壓迫脊髓,以下肢劇烈收縮作為其有效性的依據,壓迫面積0.1 cm×3 cm,壓迫5min,使小鼠脊髓中度受傷,然后移去重物,用生理鹽水沖洗傷口后進行縫合;對照組只切開錐板不對脊髓進行損傷處理。每天3次對截癱動物的膀胱區進行人工按壓排尿,并防止并發癥。觀察記錄各組小鼠雙下肢的肌張力、反射及其大小便等一般情況。

1.2.2 取材 在各個時間點分別取SCI實驗組及對照組小鼠各5只,在冰上處死,迅速取出損傷后的脊髓組織(脊髓損傷段上下約1 cm)及適量肺、脾、胸腺、腎、胃、心臟、大腦組織放入液氮罐中保存以備后緒實驗用。

1.2.3 RNA提取 使用Trizol法來提取總RNA。取適量凍存的實驗材料,加液氮研成粉末,迅速轉移至裝有3 ml預冷提取液的10 ml離心管中,混勻,依次加入0.3mlNaAc(2 mol/L,pH 4.0)、3 ml水飽和苯酚和 0.6ml氯仿-異戊醇(24∶1)充分混勻,冰浴15 min,4℃13 000 r/min離心30 min,將上層水相轉移至1.5 ml離心管中,加入等體積的預冷異丙醇,混勻,置于-20℃2 h。4℃13 000 r/min離心30 min,去上清,將沉淀用75%的乙醇洗2次,稍晾干,將沉淀溶于100 μ l DEPC處理過的超純水中,4℃16 000 r/min離心30 min。使用分光光度計檢測RNA的濃度和純度,并用1%甲醛變性瓊脂糖電泳來檢測其完整性,-70℃冰箱保存備用。

1.2.4 cDNA的合成 根據M-MLV反轉錄試劑盒說明合成cDNA,70℃水浴10 min后儲存于-20℃冰箱備用。

1.2.5 半定量 RT-PCR 用Oligo v6.0來設計STK31基因的引物,其登錄號、序列及退火溫度見表1。在實驗中實施雙管法,以β-actin基因作為內標,β-actin基因引物為:上游引物(5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′);下游引物(5′-CCACAGGA TTCCATACCCAA-3′)。以cDNA為模板在相同的反應條件下擴增STK31和β-actin基因片段,PCR反應混合體系為:2.5 μ l10 ×PCR 緩 沖液(包含 Mg2+)、2 μ g 的 cDNA、0.5 μ l 10 mmol/L的dNTPs、1U的DNA聚合酶、上游引物及下游引物各2 μ l,加無菌水補至 25 μ l。 PCR 反應程序為:94℃ 5 min,94℃45 s、57.4℃ 30 s和 72℃ 60 s共 30個循環。PCR產物在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測,拍照,通過Bandscan 5.0軟件分析各膠帶總灰度面積及灰度值,并得出STK31基因的相對表達量。

1.3 數據分析

2 結果

2.1 STK31基因在小鼠各組織中的表達特異性

通過半定量RT-PCR,結果顯示STK31基因在小鼠的腎、胃、胸腺、脊髓、肺、脾、心臟、大腦等多個器官組織中都有表達,且在脊髓中表達明顯(圖1)。

Fig.1 Expression of STK31 gene in various tissues

2.2 脊髓損傷后不同時間STK31基因的差異表達

半定量RT-PCR擴增STK31和β-actin基因所得到的產物和預期的一樣(圖2),在各實驗組中STK31基因都普遍表達。用Bandscan軟件計算兩基因的相對表達量,并經SPASS 13.0軟件進行數據統計分析,結果顯示STK31基因的表達量在損傷后4 h和1 d兩組顯著低于對照組(P＜0.01),而且在4 h、8 h、1 d、3 d呈現降低-回升-降低-回升的趨勢(圖 3)。

3 討論

脊髓損傷不僅會導致神經組織出現即刻損傷,如:局部機械性損傷、缺血、細胞壞死等,往往還會引發更為復雜的繼發性損傷,而炎癥是脊髓損傷特別是繼發性損傷過程中重要的病理反應。目前對脊髓損傷修復的分子機制研究大多集中于炎癥調節相關基因,細胞凋亡相關基因及神經修復維護相關基因上,其中就包含細胞中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員。

Fig.2 Electrophoresis photo of semi-quantitative RT-PCR of STK31 and β-actin gene

STK31是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員,結構保守,包括三個結構域:tudor結構域、SbcC結構域和絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域,其中tudor結構域在一些RNA結合蛋白中頻繁出現,或具有RNA結合功能,并已發現在果蠅發育中起重要作用,SbcC結構域具ATP酶功能可能參與DNA修復,激酶結構域位于蛋白質C端,包含絲氨酸/蘇氨酸激酶家族所有預期保守氨基酸序列[1]。已發現STK31在人,馬科動物、嚙齒動物的睪丸組織和動物胚胎腦組織中特異表達[1];此外STK31還在多種腫瘤組織中高度表達,具有促進腫瘤發生的作用[2]。然而,STK31與脊髓損傷的相關性研究至今仍未見報道。本實驗通過 R T-PCR技術檢測到STK31可在小鼠腎臟、胃、脊髓、腦、心臟等多種器官中表達,且在脊髓中表達明顯(圖1)。在小鼠脊髓損傷后STK31出現兩次顯著的下調表達(P＜0.01,圖 3),由此推斷 STK31基因可能參與小鼠SCI后的信號調控。目前對絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員的研究表明其作用范圍廣泛,包括中樞神經系統的調節與維護,細胞自我吞噬調節,免疫反應調節,鈣離子調節,細胞凋亡調節等。范睿[3]等發現脊髓損傷后4 h開始出現大量神經元和膠質細胞凋亡,其中促凋亡因子表達上升,抑凋亡因子表達下降。Sakurai[4]等認為絲氨酸/蘇氨酸激酶在脊髓損傷早期能延緩神經細胞的凋亡。本文結果顯示SCI后4 h、8 h、1 d、3 d時STK31表達呈現降低-回升-降低-回升的趨勢,而STK31的下調表達可能會加速神經細胞凋亡。此外絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶涉及免疫反應,而其表達量的恢復可能與相繼的免疫反應強化有關,這還需進一步驗證。STK31與另一種絲氨酸/蘇氨酸激酶Camk4(鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶)功能類似,暗示結構保守的STK31可能通過鈣調節作用來參與細胞應答,而鈣離子在腦和脊髓損傷特別是之后的繼發性損傷中發揮著重要的作用[5]。

[1]Sabeur K,Ball BA,Corbin C J,et al.Characterization of a novel,testis-specific equine serine/threonine kinase[J].Mol Reprod Dev,2008,75(5):867-873.

[2]Yokoe T,Tanaka F,Mimori K,et al.Efficient identification of a novel cancer/testis antigen for immunotherapy using three-step microarray analysis[J].Cancer Res,2008,68(4):1074-1082.

[3]范 睿,魯亞平,蔡亞非,等.小鼠脊髓挫傷型損傷后caspase-3、bax、bcl-2和 c-kit基因的表達[J].南京農業大學學報,2010,33(1):87-89.

[4]Sakurai M,Hayashi T,Abe K,et al.Induction of phosphatidylinositol 3-kinase and serine-threonine kinase-like immunoreactivity in rabbit spinal cord after transient ischemia[J].Neurosci Lett,2001,302(1):17-20.

[5]Wu J Y,Ribar T J,Cummings D E,et al.Spermiogenesis and exchange of basic nuclear proteins are impaired in male germ cells lacking Camk4[J].Nat Genet,25(4):448-452.