參附注射液對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用*

王振富,鐘 靈,李玉山

(1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院,2.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院,恩施 445000)

參附注射液(Shenfu injection,SFI)是根據(jù)古驗(yàn)方“參附湯”加工提煉而成,由紅參、黑附片組成,主要成分為人參皂苷和烏頭類生物堿等,具回陽(yáng)救逆、益氣固脫等功效,主要用于陽(yáng)氣暴脫的厥脫癥和陽(yáng)虛所致的驚悸、怔忡、喘咳、泄瀉、胃疼、痹癥等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,參附注射液可以通過(guò)多種途徑對(duì)缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用[1],但其藥理作用尚不十分明確。筆者已做過(guò)參附注射液對(duì)心肌缺血/再灌注損傷保護(hù)作用的研究報(bào)道[2],為進(jìn)一步探討參附注射液對(duì)大鼠全腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制,建立了全腦缺血/再灌注損傷模型(cerebral ischemia/reperfusion,CI/R)。通過(guò)對(duì)興奮性氨基酸、鈣離子和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量以及腦組織含水量和抗氧化酶活性實(shí)驗(yàn)研究。旨在為該藥直接用于防治缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

參附注射液(主要成分為人參皂苷和烏頭原堿,濃度分別為0.8 g/L和0.1g/L,批號(hào)080024)由雅安三九藥業(yè)有限責(zé)任公司提供;尼莫地平片(山東新華制藥股份有限公司);谷氨酸(glutamate,Glu)、天冬氨酸(asparate,Asp)和甘氨酸(glycine,Gly)對(duì)照品(純度99.99%,Sigma公司);丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所)

1.2 儀器

LC-10AVP高效液相色譜儀(日本津島);ODSC18色譜柱(美國(guó)WATERS公司);RF-530熒光檢測(cè)器(日本津島);AA-800原子吸收分光光度計(jì)(美國(guó)Perkin Elmer公司);UV-265紫外分光光度計(jì)(日本津島)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD大鼠,雄性,體重220～250 g,由湖北民族學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=10):假手術(shù)(sham)組、模型對(duì)照(CI/R)組、尼莫地平組和參附注射液組。

1.4 大鼠全腦缺血/再灌注模型[3]

將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g/kg),頸部腹側(cè)正中縱行切開,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,置線備用。在枕骨后第一、第二頸椎處切口,手術(shù)顯微鏡下分離暴露第一頸椎橫突翼并找到左、右橫突孔,用一直經(jīng)0.5 mm的電凝針插入橫突孔電凝兩側(cè)椎動(dòng)脈。24 h后,動(dòng)物清醒,拆除頸部縫合線,用帶硅膠管的動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸動(dòng)脈,10 min后打開動(dòng)脈夾形成再灌注。再灌注3 h后,取血、取腦進(jìn)行生化測(cè)定。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈,不做結(jié)扎與電凝。參附注射液組(10 mg/kg)分別于手術(shù)前1 d,術(shù)前1 h和再灌注前30 min尾靜脈給藥,共3次。尼莫地平組(30 mg/kg)同時(shí)間給藥,假手術(shù)組、模型對(duì)照組同時(shí)間給予同體積的生理鹽水注射。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 腦組織氨基酸遞質(zhì)含量測(cè)定 取左側(cè)大腦半球前半部,在冰臺(tái)上迅速分離前腦皮質(zhì),以冰生理鹽水沖洗后除去殘血,吸干后立即精確稱重,按質(zhì)量比1∶9加入5%三氯乙酸,高速勻漿機(jī)在冰浴下制成10%腦勻漿液,4℃保存待測(cè)。測(cè)試前保本復(fù)溶,4℃12 000 r/min離心10 min,取上清液,檢測(cè)條件及方法按文獻(xiàn)[4]的高效液相色譜法(進(jìn)樣量為100 μ l)測(cè)定腦組織谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和甘氨酸(Gly)含量。

1.5.2 腦組織SOD活性和MDA含量測(cè)定 取左側(cè)大腦半球后半部,冰盤中取腦皮質(zhì)稱重。在冰浴上按1∶9加入4℃勻漿介質(zhì)(生理鹽水),高速細(xì)胞粉碎機(jī)勻漿(14 000 r/min,30 s),3 500 r/min離心10 min。取上清液以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,分裝于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎没瘜W(xué)比色法按試劑盒操作說(shuō)明于紫外分光光度計(jì)550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定SOD活性。532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定MDA含量。

1.5.3 腦組織含水量和Ca2+含量測(cè)定 取右側(cè)大腦半球,稱濕重后置于80℃烤箱中烤至恒重,稱干重,計(jì)算腦組織含水量。將烤干腦組織碾碎,精確稱重,加入高氯酸(優(yōu)級(jí)純)6 ml和硝酸(優(yōu)級(jí)純)1 ml,12 min后,加熱消化,蒸干成鹽狀,去離子水定容,火焰原子吸收法進(jìn)行腦組織Ca2+含量測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 參附注射液對(duì)CI/R大鼠腦組織興奮性氨基酸遞質(zhì)含量的影響

腦缺血/再灌注180 min后,CI/R組大鼠腦組織Glu含量與假手術(shù)組比較明顯升高(P＜0.05),Asp和Gly均有降低趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與CI/R組比較,參附注射液組能明顯降低Glu含量(P＜0.05),對(duì)Asp,Gly含量未見(jiàn)明顯影響(表1)。

2.2 參附注射液對(duì) CI/R大鼠腦組織含水量和Ca2+含量的影

與假手術(shù)組比較,CI/R模型組大鼠腦組織含水量和Ca2+含量明顯增加(P＜0.05,P＜0.01),參附注射液能顯著降低CI/R模型組大鼠腦組織含水量和Ca2+含量,與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01,表2)。

Tab.2 Effect of Shenfu injection on the contents of CI/R rat brain tissue water and Ca2+(±s,n=10)

Tab.2 Effect of Shenfu injection on the contents of CI/R rat brain tissue water and Ca2+(±s,n=10)

CI/R:Cerebral ischemia/reperfusion*P＜0.05,**P＜0.01 vs sham;#P＜0.05,##P＜0.01 vs CI/R

Group Dosage(mg/kg)Wate content(%)Ca2+(μ g/g)Sham 78.04±0.22 176.60±44.58 CI/R 78.77±0.41* 196.51±49.06**Nimodiping 30 78.48±0.84 162.61±49.06 Shenfu injection 10 77.93±0.46# 136.84±38.20##

2.3 參附注射液對(duì)CI/R大鼠腦組織SOD活性與MDA含量的影響

與假手術(shù)組比較,CI/R模型組大鼠腦組織SOD活性明顯降低,MDA含量明顯升高(P＜0.05)。參附注射液和尼莫地平能顯著升高CI/R模型組大鼠腦組織SOD活性和SOD/MDA比值,與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05);對(duì)MDA含量有降低趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

Tab.3 Effect of Shenfu injection on activity of the CI/R rat tissue SOD and MDA content(±s,n=10)

Tab.3 Effect of Shenfu injection on activity of the CI/R rat tissue SOD and MDA content(±s,n=10)

SOD:Superoxide dismutase;MDA:Malondialdehyde;CI/R:Cerebral ischemia/reperfusion*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs CI/R

Group Dosage(mg/kg)SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)SOD/MDA Sham 92.48±20.4717.87±32.99 5.37±1.77 CI/R 73.71±13.88*24.22±7.18 3.35±1.22*Nimodiping 30 99.66±31.32#21.94±6.17 4.68±1.34#Shenfu injection 10 98.61±29.33#21.55±4.30 4.59±1.06#

3 討論

腦缺血/再灌注,引起腦組織損傷及機(jī)能障礙,其機(jī)理尚未完全明了。目前認(rèn)為,腦缺血/再灌注后的損傷,可能與氧自由基、一氧化氮、細(xì)細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎細(xì)胞浸潤(rùn),興奮性氨基酸的毒性等有關(guān),特別是氧自由基學(xué)說(shuō)在其中占有重要地位[5]。已證明缺血性腦損傷是由于缺血后能量耗竭引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果,其激發(fā)點(diǎn)是神經(jīng)元去極化和細(xì)胞外興奮性氨基酸(excitatory amino acid,EAA)含量增加;細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,Ca2+依賴性酶的激活和自由基形成等是興奮性毒性對(duì)神經(jīng)元損傷的重要因素;花生四烯酸代謝產(chǎn)生多種血管活性物質(zhì)引起的血管收縮和血栓形成,多種細(xì)胞毒性細(xì)胞因子釋放引起的炎性反應(yīng),進(jìn)一步加重腦缺血和細(xì)胞損傷[6]。

另一方面,腦缺血缺氧導(dǎo)致能量代謝耗竭,Na+,K+-ATP酶功能障礙,神經(jīng)元去極化而觸發(fā)動(dòng)作電位,神經(jīng)末梢釋放EAA增加;ATP酶的減少使突觸前膜能量重?cái)z取EAA減少,使大量的EAA聚集于突出間隙。EAA作用于突觸后膜受體,引起配體門控性離子通道開放,Na+Cl-和H2O先后順濃度差、電位差和滲透壓內(nèi)流,在引起去極化而誘發(fā)動(dòng)作電位同時(shí),導(dǎo)致突觸后神經(jīng)元急性腫脹,形成早期細(xì)胞損傷。質(zhì)膜的去極化是電壓門控性Ca2+通道開放,EAA作用于突觸后膜離子型受體開放配體門控性Ca2+通道和胞內(nèi)升高的Na+濃度使Na+-Ca2+交換增加,Ca2+大量?jī)?nèi)流造成Ca2+超載;EAA作用于突觸后膜代謝型受體,通過(guò)G蛋白偶聯(lián)第二信使,激活磷脂酶 C,分解磷脂肌醇,產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3),作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上特異性受體(IP3R),使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+;此外,由于ATP依賴性Ca2+,泵功能減弱,Ca2+排除減少,進(jìn)一步加重Ca2+超載[7]。

MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,可直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度。SOD常作為清除自由基能力的重要指標(biāo),SOD活性的高低可反映體內(nèi)清除自由基的能力。因此測(cè)定這些物質(zhì)的活性或者含量變化可以反映出機(jī)體腦組織自由基水平和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的強(qiáng)弱,可作為觀察藥物抗腦組織缺血/再灌注損傷作用的有效指標(biāo)。

腦水腫是腦缺血后病理發(fā)展的必然結(jié)果,也是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)不可逆損害的重要因素之一。缺血引起腦水腫屬于混合性腦水腫,即血管源性水腫與細(xì)胞毒性水腫,主要機(jī)制是腦內(nèi)毛細(xì)血管通透性增加,大量水腫液滲出并集中在腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞及血管周圍的細(xì)胞間隙內(nèi),引起顱內(nèi)壓增高及實(shí)質(zhì)細(xì)胞代謝障礙。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,四動(dòng)脈阻斷建立大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型,動(dòng)物出現(xiàn)明顯腦水腫,同時(shí)伴有腦組織EAA、Ca2+和MDA含量顯著升高,SOD活性明顯降低。與其他相關(guān)報(bào)道基本一致[8,9]。參附注射液能明顯減輕腦水腫,顯著升高SOD活性和SOD/MDA比值,顯著降低EAA和Ca2+含量,而對(duì)抑制性氨基酸遞質(zhì)無(wú)明顯影響。說(shuō)明參附注射液通過(guò)降低興奮性氨基酸(EAA)毒性、阻滯Ca2+超載和提高抗氧化能力等多種途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。

[1]鄭曙云,徐建國(guó),趙振中.參附注射液對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,24(6):541-544.

[2]王振富.參附注射液對(duì)心肌缺血/再灌注損傷血流動(dòng)力學(xué)和心肌酶的影響[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2011,27(2):155-157.

[3]徐叔云,卞如濂,陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002.1065.

[4]Chen BM,Xia L M,Zhao RQ.Determination of N G,NG-dinmethy larginine in human plasma by higli performance liquid chromgraphy[J].J chormat ography B,1997,692(2),467-471.

[5]Traystman R J,Kirsch J R,Koehler R C.Oxygen radical mechanisms of brain injury following ischemia and reperfusion[J].J Appl Physiol,1991,71(4):1185-1195.

[6]邵福源,王宇卉.分子神經(jīng)藥理學(xué)[M].北京:上海科技術(shù)出版社,2005.337.

[7]王 軍,黃啟福,劉惠霞,等.生姜水提物對(duì)全腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織氨基酸遞質(zhì)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(21):184-187.

[8]馮 泉,黃 帆,馬中富,等.腦缺血后腦組織NO、EAA和DA含量的變化[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2004,4(2):172.

[9]崔景斌,王俊萍,鄢文海,等.大鼠腦缺血再灌注損傷后興奮性氨基酸、NOS和NO的含量變化[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2002,37(2):169.