中樞氧化應激抑制高血壓大鼠壓力感受性反射功能*

黨 娜,潘燕霞

(1.福建醫科大學基礎醫學院生理與病生學系,2.福建醫科大學醫學技術與工程學院康復治療學系,福州 350004)

動脈壓力感受性反射(arterial baroreflex,ABR)簡稱壓力反射,是維持血壓穩態的重要調節機制,它實時監測血壓波動,以負反饋方式保持動脈血壓相對穩定。壓力反射功能減弱與高血壓的發生發展密切相關[1,2],而且增加腦卒中、致死性心律失常和猝死等心血管事件的發生[3,4]。因此,探討壓力反射功能減弱的機制對預防高血壓的發生及不良預后具有重要意義。

壓力反射功能減弱可發生在反射弧任何一個環節,但主要與動脈壓力感受器鈍化和心血管中樞整合功能異常有關。刺激頸動脈竇壓力感受器能降低高血壓說明感受器敏感性降低是壓力反射功能減弱的重要原因之一[5]。臨床研究發現,高血壓前期患者或者有高血壓家族史的、但血壓正常的年輕人,其壓力感受器功能尚未改變時,壓力反射功能就已降低[2]。動物實驗也證實,自發性高血壓大鼠(sponta-neously hypertensive rat,SHR)壓力感受器傳入沖動正常時,壓力反射功能就已減弱,提示壓力反射功能減弱可能與反射中樞異常有關,但壓力反射功能減弱的中樞機制目前尚未完全明了。

許多研究表明,高血壓與氧化應激密切相關。高血壓患者血漿中丙二醛含量增加,而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶及谷胱苷肽過氧化酶等活性下降[6],提示抗氧化能力減弱是造成氧化應激的原因之一。應用SOD擬似劑Tempol提高抗氧化能力則降低高血壓[7],靜脈給予Tempol還能改善腎性高血壓大鼠受損的壓力反射功能[8],但這主要作用于外周壓力感受器。氧化應激對中樞血壓調節的影響尚不清楚。我們先前實驗證實,降低腦內活性氧水平能改善心衰大鼠受抑的壓力反射功能[9]。但高血壓狀態壓力反射功能減弱是否與腦內氧化應激有關報道甚少,造成中樞神經系統氧化應激的原因也不清楚。本實驗以SHR為研究對象,改變腦內活性氧水平,觀察對壓力反射功能影響,探討腦內氧化應激與高血壓大鼠壓力反射功能改變的關系;并檢測腦組織丙二醛代表腦組織氧化應激水平,檢測腦組織總抗氧化能力、SOD,CuZn-SOD、過氧化物酶活性以明確中樞氧化應激的來源。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

4-羥基-2,2,6,6-四甲基氧基哌啶(4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl,Tempol)、二乙級二硫代氨基甲酸(diethyldithiocarbamic acid,DETC),美國Sigma公司),總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、銅/鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、過氧化氫酶 (catalase,CAT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)等試劑盒(南京建成生物技術有限公司),BCA試劑盒(碧云天生物技術公司)。

1.2 動物及分組

10只雄性自發性高血壓大鼠(330～380 g)為實驗組,12只正常血壓Wistar大鼠為對照組(體重350～400 g),實驗動物由中國科學院上海實驗動物研究中心提供。

1.3 動物血壓、心率記錄

大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯(800 mg/kg)和α-氯醛糖(40 mg/kg),氣管插管,自主呼吸。右側股動脈插管記錄血壓和平均動脈壓(MAP),同側股靜脈插管用于靜脈給藥。采用標準II導聯記錄心電,心電信號輸入BL-420F型實驗系統轉化成心率(HR),MAP和HR信號同步保存于BL-420F型實驗系統。

1.4 壓力感受性反射功能檢測

采用靜脈注射血管舒縮劑改變血壓以激活壓力反射,以壓力反射敏感性(baroreflex sensitivty,BRS)代表壓力反射功能。BRS測定方法:靜脈注射苯腎上腺素 (phenylephrine,PE)3 μ g/kg 、6 μ g/kg 、15 μ g/kg升高血壓,引起反射性心動過緩,反映壓力反射對升壓的敏感性;靜脈注射硝普鈉(sodium nitroprusside,NP)3 μ g/kg 、6 μ g/kg 、15 μ g/kg 降低血壓 ,引起反射性心動過速,反映壓力反射對降壓的敏感性;將血壓變化值與心率變化值進行直線回歸分析,該直線的斜率代表BRS。PE和NP交替給藥,兩次給藥間隔10～20 min。

1.5 側腦室給藥

大鼠頭部固定于腦立體定位儀上,根據Paxinos和Watson大鼠腦圖譜進行定位。側腦室坐標分別是:前囟后0.8 mm,中線旁開 1.4 mm,顱骨表面下3.8 mm。將微量進樣器固定在微操縱器上,用于側腦室給藥。

為了觀察腦內活性氧水平改變對壓力反射功能的影響,SHR和正常大鼠分成兩組:一組側腦室注射SOD 擬似劑Tempol(50 μ mol/kg),另一組側腦室注射 SOD 抑制劑 DETC(50 μ mol/kg),每組 5-6 只 。

Tempol和DETC給藥前,向側腦室注射生理鹽水(10 μ l/3min)作為對照,隨后靜脈注射PE(6 μ g/kg)激活壓力感受反射,測定壓力反射敏感性(baroreflex sensitivity,BRS)。間隔 20～30 min后,側腦室緩慢注射Tempol或 DETC,給藥體積為 10 μ l,注射時間給3～4 min,給藥后再測定BRS。實驗結束,迅速取出全腦組織,-80℃保存備用。

1.6 下丘腦 MDA、T-AOC、SOD、CAT等測定

凍存腦組織在冰盤上分離出下丘腦,按1∶9加入預冷勻漿緩沖液,電動勻漿,低溫離心(3 000 r/min)10 min,保留上清待測。BCA試劑盒測定上清液蛋白濃度。

MDA 、T-AOC、SOD、CAT等試劑盒購自南京建成生物技術公司,嚴格按照說明書進行操作,選擇相應的波長,用酶標儀測定樣品的吸光值,并用樣品蛋白濃度進行標化。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 高血壓大鼠MAP、HR、BRS變化

高血壓大鼠MAP(138.5±11.3)mmHg明顯高于正常大鼠(87.4±8.5)mmHg(P＜0.01),HR(344±22)b/min與正常大鼠(328±26)b/min無明顯差別。PE呈劑量依賴性升高血壓,并引起反射性心率減慢(表1),兩組升壓幅度無明顯差異,但高血壓組心率減慢的幅度明顯小于正常組(P＜0.01,表1)。相反,NP則引起劑量依賴性降壓和反射性心率增快,高血壓大鼠降壓幅度明顯大于正常組(P＜0.05),但心率變化卻小于正常組(P＜0.01,表2)。

Tab.1 PEinduced dose-dependent pressor and reflex bradycardia in SHR and control groups(±s)

Tab.1 PEinduced dose-dependent pressor and reflex bradycardia in SHR and control groups(±s)

SHR:Spontaneously hypertention rats;PE:Phenylephrine;MAP:Meah aortic pressure;HR:Heart ratie*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group

Group Δ MAP(mmHg) ΔHR(b/min)Control 3 μ g/kg 17.3 ±4.4 -18.2±2.9(n=12) 6 μ g/kg 27.5 ±5.3 -57.9±7.0 15 μ g/kg 49.7±7.0 -111.8±16.7 SHR 3 μ g/kg 19.6 ±4.3 -15.1±2.4(n=10) 6 μ g/kg 32.6 ±6.6 -41.0±10.5**15 μ g/kg 60.7 ±5.4* -78.7±12.7**

Tab.2 NP induced dose-dependent depressor and reflex bradycardia in SHR and control groups(±s)

Tab.2 NP induced dose-dependent depressor and reflex bradycardia in SHR and control groups(±s)

SHR:Spontaneously hypertention rats;NP:Nitroprusside;MAP:Mean aortic pressure;HR:Heart ratie*P＜0.05,**P＜0.01 vs control group

Group Δ MAP(mmHg) ΔHR(b/min)Control 3 μ g/kg -9.4 ±3.2 10.6±4.1(n=12) 6 μ g/kg -17.3 ±5.1 23.2±6.81 15 μ g/kg -41.9 ±8.2 54.2±12.8 SHR 3 μ g/kg -13.3 ±3.1 6.6±2.1(n=10) 6 μ g/kg -29.8 ±7.0* 15.9±5.41 15 μ g/kg -55±9.7** 31.7±8.9**

將心率變化與血壓變化進行直線相關分析,該直線的斜率代表平均的BRS。PE誘導高血壓大鼠的BRS為-1.3(r=0.89)明顯小于正常大鼠-2.3(r=0.92,P＜0.01,圖 1);同樣地,NP誘導的BRS,高血壓組為-0.6(r=0.88)也小于正常大鼠-1.3(r=0.94,P＜0.01,圖 1)。

2.2 Tempol和DETC對高血壓和正常大鼠BRS的影響

為了判斷高血壓大鼠壓力反射敏感性降低是否與腦內氧化應激有關,側腦室緩慢注射超氧陰離子捕獲劑Tempol。與注射生理鹽水相比(表3),Tempol能增強高血壓大鼠BRS(P＜0.05),但對正常大鼠BRS無明顯影響;而側腦室給予SOD抑制劑DETC,則顯著降低正常大鼠BRS(P＜0.01,表3),DETC輕度抑制高血壓大鼠BRS(P＜0.05)。

Fig.1 Linear regression slopes represent average BRS obtained from the data on MAP-HR relationship induced by phenylephrine and nitroprusside in SHR and Control group

Tab.3 Effects of intracerebroventricular infusion of tempol and DETC on BRS in SHR and control group(±s)

Tab.3 Effects of intracerebroventricular infusion of tempol and DETC on BRS in SHR and control group(±s)

NS:Normal saline;BRS:Baroreflex sensitivity;SHR:Spontaneously hypertention rats*P＜0.05,**P＜0.01 vs NS

Group n BRS BRS NS Tempol NS DETC Control 6 2.1±0.38 2.2±0.45 2.3±0.32 1.52±0.46**SHR 5 1.06±0.361.84±0.31*0.94±0.12**0.61±0.13*

2.3 高血壓大鼠下丘腦MDA含量、總抗氧化能力和抗氧化酶活性改變

脂質過氧化產物丙二醛(MDA)是代表氧化應激水平的重要標志物。高血壓大鼠下丘腦MDA明顯高于正常大鼠(P＜0.01,圖2A)。相反,高血壓大鼠下丘腦總抗氧化能力(T-AOC)比正常大鼠降低41%(P＜0.05,圖2B),而且總SOD和Cu-ZnSOD活性較正常大鼠明顯降低(P＜0.05,圖2C;P＜0.05,圖2D)。

過氧化氫酶(CAT)是降解H2O2的抗氧化酶,高血壓大鼠下丘腦CAT為19.7±9.1 U/mg prot。較正常大鼠44.36±15 U/mg prot.降低了53%(P＜0.01)。

3 討論

動脈壓力反射功能減弱與高血壓發病密切相關,本實驗采用血管舒縮劑PE和NP激活壓力反射,以BRS評價壓力反射功能。結果顯示,高血壓大鼠壓力反射調節心率的作用明顯降低,無論是PE的升壓還是NP的降壓反應,高血壓大鼠BRS均明顯低于正常大鼠,表明高血壓狀態下壓力反射功能減弱。這與高血壓患者[1,2]和高血壓大鼠[8]所觀察的結果一致。

Fig.2 Changes in MDA content,total antioxidant capacity and antioxidant enzyme activity in hypothalamus.

壓力反射功能減弱主要與感受器敏感性降低和反射中樞整合功能異常有關。有研究認為,高血壓動脈硬化降低頸動脈竇和主動脈弓壓力感受器敏感性,傳入沖動減少,導致壓力反射功能減弱,因此,刺激壓力感受器能增強壓力反射功能,產生降壓作用[5]。壓力反射功能降低的外周機制已有較統一認識,但其中樞機制較復雜,目前尚未完全闡明。

下丘腦是壓力反射重要的整合中樞,其下行纖維投射到延髓頭端腹外側區和脊髓中間外側柱,影響交感傳出神經活動,從而調節壓力反射功能。Gao等[10]報道心衰家兔延髓頭端腹外側區超氧陰離子增加削弱壓力反射功能,我們實驗室曾報道心衰大鼠壓力反射功能衰減與下丘腦活性氧水平升高密切相關[9]。本實驗也觀察到,高血壓大鼠下丘腦MDA水平明顯高于對照組,表明壓力反射功能降低與心血管中樞氧化應激有關。為了進一步明確氧化應激對壓力反射功能的影響,本實驗應用側腦室給藥,結果顯示SOD擬似劑Tempol能增強高血壓大鼠壓力反射調節心率的作用,恢復受損BRS;相反,SOD抑制劑DETC則明顯抑制高血壓和正常大鼠壓力反射功能,降低兩組大鼠BRS。Botelho-Ono等[8]人在腎性高血壓大鼠也觀察到,靜脈給予NADPH氧化酶抑制劑apocynin和維生素C能恢復受損的BRS。上述結果提示降低氧化應激能恢復受損的壓力反射功能,從另一方面證明中樞氧化應激降低壓力反射功能。

機體氧化應激取決于自由基生成與清除之間的平衡,SOD是體內重要的抗氧化酶。有報道,高血壓患者血漿SOD、過氧化氫酶及谷胱苷肽過氧化酶等活性下降[6],提示抗氧化酶活性降低可能是高血壓氧化應激的原因之一。本實驗結果顯示,高血壓大鼠下丘腦總抗氧化能力低于正常大鼠,總SOD活性和CuZn-SOD活性較正常對照組分別降低了30%和32%,過氧化氫酶活性也比正常大鼠降低53%。本實驗結果表明高血壓大鼠中樞氧化應激可能源于下丘腦抗氧化酶活性降低。

總之,本實驗證明高血壓壓力反射調節心率功能減弱與下丘腦氧化應激密切相關,中樞抗氧化酶活性降低可能是導致氧化應激的重要機制。

[1]Narkiewicz K,Grassi G.Impaired baroreflex sensitivity as a potential marker of cardiovascular riskin hypertension[J].J Hypertens,2008,26(7):1303-1304.

[2] Krontor ádová K,Honz í ková N,Fiser B,et al.Overweight anddecreased baroreflex sensitivity asindependent risk factors for hypertension in children,adolescents,and young adults[J].Physiol Res,2008,57(3):385-391.

[3] Celovská D,Stasko J,Gonsorc í k J,et al.The significance of baroreflex sensitivity in hypertensive subjects with stroke[J].Physiol Res,2010,59(4):537-543.

[4]Johansson M,Gao S A,Friberg P,et al.Baroreflex effectiveness index and baroreflex sensitivity predict all-cause mortality and sudden death in hypertensive patients with chronic renal failure[J].J Hypertens,2007,25(1):163-168.

[5]Heusser K,Tank J,Engeli S,et al.Carotid baroreceptor stimulation,sympathetic activity,baroreflex function,and blood pressure in hypertensive patients[J].Hypertens,2010,55(3):619-626.

[6]Redón J,OlivaM R,Tormos C,et al.Antioxidant activities and oxidative stress by products in human hypertension[J].Hypertens,2003,41(5):1096-1101.

[7]Chen X,PatelK,ConnorsSG,et al.Acute antihypertensive action of Tempol in the spontaneously hypertensive rat[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(6):H3246-3253.

[8]Botelho-Ono M S,Pina H V,Sousa K H,et al.Acute superoxide scavenging restoresdepressedbaroreflex sensitivity in renovascular hypertensive rats[J].Auton Neurosci,2011,159(1-2):38-44.

[9]潘燕霞,王 瑋.中樞活性氧升高介導心力衰竭時壓力感受性反射功能衰減[J].中國病理生理雜志,2009,25(5):833-838.

[10]Gao L,Wang W,Li Y L,et al.Superoxide mediates sympathoexcitation in heart failure:roles of angiotensin II and NADPH oxidase[J].Circ Res,2004,95(9):937-944.