銀杏葉提取物對糖尿病大鼠學習記憶能力及海馬神經元NGF、NT-3表達的影響*

趙 競,金可可,吳 亮,陳國榮,李劍敏△

(1.溫州醫學院病理生理學教研室,溫州 325035;2.溫州醫學院附屬第一醫院病理科,溫州 325003)

糖尿病可導致糖尿病腦病(diabetic encephalopathy,DE)目前已成共識[1],其主要特征表現為認知功能減退、學習記憶力減弱、智力降低、情緒障礙等精神功能紊亂。近幾年來,神經營養因子對影響認知的中樞膽堿能神經元的神經營養支持作用、抑制細胞的凋亡、調節突觸可塑性等作用在糖尿病腦病中特別引起研究者關注,而且認為神經營養因子的缺乏是糖尿病腦病的病理機制之一[2]。神經營養因子的缺乏導致神經生存轉導信號的異常,Bax表達增強、Bax/Bcl-2比值增大引發凋亡級聯反應使神經元凋亡[3]。

我們前期的實驗發現銀杏葉提取物(extract of Ginkgo biloba,EGB)可通過降低海馬Bax的表達、減小Bax/Bcl-2比值從而減少神經細胞的凋亡,提高神經細胞的密度,保護I型糖尿病大鼠的認知功能的損傷[4]。但EGB對糖尿病大鼠海馬的抗凋亡作用是否與其影響糖尿病大鼠海馬神經元的神經營養因子的表達有關,有待進一步證實。本課題用STZ誘導I型糖尿病模型,進一步研究EGB對海馬神經神經生長因子(nerve growth factor,NGF)、神經營養因子-3(neurotrophin-3,NT-3)表達的影響,探討EGB對糖尿病腦病的保護機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設備

鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)及枸櫞酸鈉分析純購于美國sigma公司;銀杏葉提取物(EGB)購于北京雙鶴高科天然藥物有限公司,批號:100718;兔抗鼠NGF、NT-3多克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗購于北京中杉生物技術有限公司;NGF、NT-3、及β-actin引物合成并訂購于上海生工生物工程有限公司;BCA蛋白定量測定試劑盒購自美國Pierec公司,BeyoECL Plus(免疫印跡化學發光試劑盒)購自碧云天生物技術有限公司;Morris水迷宮由溫州醫學院藥理研究所提供。MUVB-20凝膠成像分析系統(美國Ultralum公司)。

1.2 實驗動物的分組和糖尿病模型的建立

SPF級標準健康雄性SD大鼠30只,由溫州醫學院實驗動物中心提供,動物許可證號:SYXK(浙2010-0150),體重180～220 g,鼠齡2個月,隨機分成正常對照組(10只)和糖尿病模型組(20只),糖尿病模型組大鼠禁食12 h后,按65 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素,正常對照組則給予等體積的生理鹽水腹腔注射。注射后72 h測血糖在13.8 mmol/L以上者為制造模型成功。成功模型大鼠隨機分為糖尿病組(DM組)、銀杏葉組(EGB組)。EGB組按8 mg/(kg.d)劑量腹腔注射EGB,糖尿病組和正常對照組則給予等體積的生理鹽水腹腔注射。所有動物自由進食、飲水,飼養,每周測體重1次,每兩周測血葡萄糖1次,飼養12周后行股動脈放血處死大鼠。冰浴上立即取出腦并分離兩側海馬組織,并將海馬組織分別固定于10%中性福爾馬林液及-70℃儲存備用。

1.3 大鼠生長過程中的相關指標的測定

觀察大鼠精神狀態、每周監測各組大鼠的體重,并每兩周行斷尾采血法(采用Johnson穩步倍加血糖儀)測定大鼠血糖以動態監測大鼠血糖水平的變化。

1.4 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮圓形,直徑 1.5 m,平臺直徑12 cm,水深30 cm。平臺置于迷宮東北象限正中,水面高出平臺5 cm,水溫保持在22℃～25℃。各組大鼠在實驗第12周開始水迷宮訓練,將大鼠移至暗室中適應30 min后開始測定。訓練或測試時大鼠頭朝池壁,分別從正東、正南、正西、正北四個象限入水,設定最長游動時間為120 s。120 s未找到平臺者,將其引至平臺,放置30 s引導其學習與記憶。每只大鼠每天實驗一次,共進行5 d,前4天為訓練時間,第5天為測試。數據采集及圖像分析均有圖像自動監視和處理系統完成。實驗結束后記錄各實驗動物的搜索到達平臺所需的時間或稱潛伏期和搜索平臺的策略(直線式,記分4分;曲線式,記分3分,隨機式,記分2分;圓圈式,記分1分)。

1.5 Western bot免疫印跡法檢測海馬組織中NGF和NT-3的蛋白表達

于-70℃冰箱取出海馬組織(每組各3只),Western bot免疫印跡法具體步驟同前期試驗所述[4],所用一抗濃度:NGF 1∶500、NT-3 1∶500、GADPH 1∶1 000、二抗濃度:1∶5 000

1.6 RT-PCR法檢測大鼠海馬組織NGF和NT-3的mRNA的表達

于-70℃冰箱取出海馬組織,按Trizol試劑說明書方法提取海馬組織總RNA。取1 μ g進行RT-PCR反應。所用RT-PCR擴增引物(β-actin為內參對照)如表1。PCR變性、退火和延伸溫度分別為94℃,56℃和72℃,反應時間分別為15 s,45 s和60 s,共進行35個循環。循環完畢再 72℃延伸 10 min。PCR產物用2%瓊脂凝膠電泳分析。電泳后在紫外燈下拍攝照片,然后用MUVB-20凝膠成像分析系統(美國Ultralum公司)對每一標本的PCR產物擴增的特異性片段進行灰度掃描,以β-actin密度作為參考定量標準,數值以兩者之積分吸光度的比值表示。

Tab.1 Sequence of primers and length of PCR products

1.7 統計學處理

采用SPSS 18.0統計學軟件進行分析,計量資料以均數±標準差(±s)表示,多組比較用單因素方差分析,均數間的兩兩比較用q檢驗。

2 結果

2.1 一般情況

Con組大鼠體型適中,精神狀況良好,動作自如,反應靈敏,毛發平伏有光澤;DM組大鼠消瘦,精神萎靡,反應遲鈍,毛豎無光澤,動作遲緩,弓背蜷體;EGB組相對DM組大鼠體型較胖,精神狀況與正常無差別,毛發較有光澤,活動度較好。在為期12周的實驗中,每周比較各組實驗大鼠的體重,DM組大鼠的體重明顯低于Con組和EGB組(P＜0.05,圖1)。

Fig.1 Weight change of each group rat(±s,n=8～10)Con:Control group;DM:Diabetic group;EGB:EGB-treated group

2.2 EGB對I型糖尿病大鼠血糖水平的影響

在為期12周的試驗中,Con組大鼠血糖穩定在正常水平,DM組大鼠血糖升高并趨持續升高狀態,而EGB組血糖明顯低于DM組,并相對穩定,無持續升高的趨勢,DM組和EGB組比較,有顯著差異(P＜0.05,圖2)。

Fig.2 Effect of EGB on blood glucose of rats in each group(±s,n=8～10)

2.3 實驗動物的空間學習記憶能力測試及評價

Morris水迷宮實驗的第1～2天,各組間潛伏期比較無顯著差異(P＞0.05);第3天出現正常對照組潛伏期明顯較DM組和EGB組縮短(P＜0.05,P＜0.01),而DM組和EGB組比較差異無統計學意義(P＞0.05);第4天出現正常組、EGB組的潛伏期均明顯較DM組縮短(P＜0.01),但正常組與EGB組比較無顯著差異(P＞0.05);第5天出現正常組、EGB組的潛伏期均明顯較DM組縮短(P＜0.05,P＜0.01),但正常組與EGB組比較無顯著差異(P＞0.05,圖3)。比較第5天各組實驗大鼠搜索平臺的策略:從高分到低分依次為正常對照組＞EGB組＞DM組,DM組分別與正常對照組和EGB組比較均有顯著性差異(P＜0.01),而正常對照組與EGB組比較無顯著性差異(P＞0.05,圖4)。

Fig.3 Effect of EGB on escape latency of Morris water maze test(±s,n=10)

Fig.4 Effect of EGB on the platform searching score of Morris water maze test(±s,n=10)

2.4 各組大鼠海馬神經細胞的形態學觀察

取各組海馬組織,10%福爾馬林液固定,常規HE染色,光鏡下可見Con組大鼠海馬神經元排列緊密,未見明顯的神經元核固縮或體積縮小;DM組、EGB組大鼠海馬區神經細胞出現不同程度的核固縮,細胞體積變小,部分區細胞稀少,海馬區神經細胞排列紊亂,以CA1和CA2段為著,但EGB組大鼠的海馬區的病變相對減少(圖5,見彩圖頁Ⅰ)。

2.5 各組大鼠海馬組織NGF、NT-3蛋白Western blot的檢測結果

NGF和NT-3蛋白在Con組大鼠海馬組織中的表達分別為0.827±0.115;2.643±0.344;在EGB組大鼠海馬組織中的表達分別為0.987±0.006;2.48±0.12;而兩者在DM組大鼠海馬組織中的表達明顯減弱,分別為 0.563±0.119;1.563±0.471。DM組大鼠海馬組織NGF和NT-3蛋白的表達分別與Con組、EGB組比較,差異顯著(P＜0.05,圖6)。

Fig.6 Western blot analysis of NGF and NT-3 in hippocampus of rats(±s,n=3)

2.6 各組大鼠海馬組織中NGF、NT-3基因的mRNA表達的RT-PCR檢測結果

NGF mRNA和NT-3 mRNA在Con組大鼠海馬組織中的表達分別為1.709±0.007;4.72±0.243;在EGB組大鼠海馬組織中的表達分別為1.749±0.054;4.35±0.042;而兩者在DM組大鼠海馬組織中的表達明顯減弱,分別為0.912±0.094;2.456±0.237。DM組大鼠海馬組織NGF mRNA和NT-3 mRNA的表達分別與Con組、EGB組比較,差異顯著(P＜0.05,圖 7)。

3 討論

我們前期的實驗發現I型糖尿病大鼠認知功能的障礙與海馬神經元的丟失,神經元的凋亡密切相關。EGB可通過線粒體通路減少海馬神經元的凋亡,提高海馬神經元密度從而減少糖尿病對海馬神經元的損傷,保護糖尿病腦病大鼠的認知功能。事實上,神經元存活和凋亡都是通過復雜的調控機制完成的[5,6]。

Fig.7 RT-PCR analysis of NGF mRNA and NT-3 mRNA in hippocampus of rats(±s,n=3)

神經營養因子家族(neurotrophic factors,NTFs)是一類小分子多肽物質,在神經系統的發生、發育過程中能促進細胞的增殖、生長、生存及功能表達。在成熟的神經系統中具有維持神經細胞生存的作用。經典的NTFs包括神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養因子-3(NT-3)和神經營養因子4/5(NT4/5)等,它們具有同源性。研究發現NGF、NT-3對海馬等膽堿能神經元的抑制凋亡作用是通過它們與其特異性的受體(p75和TrKs)的結合而發揮生物學效應的[7,8]。NGF、NT-3均可以與其特異性的受體(p75和TrKA)的結合,主要通過PI-3K/AKT和ras-MAPK通路激活神經細胞內的信號轉導,維持神經元的存活;反之,在凋亡等損傷刺激因子的作用下,神經營養因子缺乏可使神經元功能受損,促凋亡蛋白Bax表達增加,Bax/Bcl-2的比值增大引發凋亡級聯反應導致神經元凋亡的發生[3]。

本實驗通過STZ誘導的I型糖尿病大鼠的模型,動態觀察糖尿病大鼠的體重和血糖變化,發現12周內糖尿病大鼠的血糖一直趨于上升的趨勢,同時體重明顯的減輕。12周末的Morris水迷宮實驗顯示糖尿病大鼠潛伏期延長,搜索平臺的策略明顯降低,提示此時糖尿病大鼠已經出現明顯的認知功能損傷。海馬組織學觀察發現糖尿病腦病大鼠海馬結構的異常,表現為海馬區神經細胞出現不同程度的核固縮,細胞體積變小,部分區細胞稀少,海馬區神經細胞排列紊亂。說明12周的模型大鼠出現認知功能損傷的同時海馬形態學也表現異常。研究表明海馬與學習記憶功能密切相關,海馬的損傷直接影響其功能。本實驗Western blot免疫印跡和RT-PCR的實驗結果發現糖尿病大鼠海馬組織中NGF、NT-3蛋白含量及mRNA的表達都明顯低于正常對照組,提示糖尿病大鼠海馬神經元處于神經營養因子的缺乏或低營養狀態。糖尿病大鼠海馬神經元的神經營養因子的缺乏,神經元生存能力的降低,導致海馬神經元的丟失(主要表現為凋亡)與認知功能障礙有關。神經營養因子的缺乏可能是糖尿病腦病大鼠認知功能障礙的重要原因[9]。最近有研究發現,增加海馬區NGF水平能夠減少老化鼠的腦神經元凋亡,從而降低腦組織老化和神經元損害的風險[10]。本實驗EGB干預治療后,糖尿病大鼠的體重增加、血糖明顯改善,海馬神經元的病理學改變減輕。Morris水迷宮實驗顯示糖尿病大鼠潛伏期縮短,搜索平臺的策略明顯提高,提示EGB能改善糖尿病腦病大鼠的認知功能,同時也說明減輕糖尿病大鼠海馬神經元的損傷可改善糖尿病大鼠的認知功能。Western blot免疫印跡和RT-PCR的實驗結果發現EGB干預后糖尿病大鼠海馬的NGF、NT-3的表達明顯增加,可見EGB能有效提高糖尿病大鼠海馬神經元的NGF、NT-3的表達。實驗結果提示EGB改善糖尿病大鼠的認知功能障礙與其提高糖尿病腦病大鼠海馬神經元的NGF、NT-3的表達水平,緩解或部分緩解海馬神經元神經營養缺乏有關。

我們前期的實驗發現EGB可降低糖尿病大鼠海馬神經元的Bax、Caspase-3的表達以及Bax/Bcl-2的比值,減少神經元的凋亡,提示EGB可通過線粒體凋亡途徑發揮其抗神經元凋亡作用的。而Bax、Bcl-2和caspase-3等是PI-3K/AKT和ras-MAPK通路的下游分子,因此,我們推斷EGB增加糖尿病大鼠海馬神經元的神經營養因子NGF、NT-3的表達,NGF、NT-3與其受體結合后,可能通過PI-3K/AKT和ras-MAPK通路下調糖尿病大鼠海馬神經元Bax、Caspase-3的表達及Bax/Bcl-2的比值,從而提高神經元的抗凋亡的能力,發揮其對糖尿病大鼠認知功能的保護作用。但其內在的機制尚未完全清楚,有待進一步的深入研究。

[1]Mijnhout G S,Scheltens P,DiamantM,et al.Diabetic encephalopathy:A concept in need of a definition[J].Diabetol,2006,49(6):1447-1448.

[2]尹國平,陳 麗.神經營養因子與糖尿病腦病[J].國際內分泌代謝雜志,2006,26(2):119-122.

[3]Juan J,Yankner B A.Apoptosis in the nerve system[J].Nature,2000,407(6805):802-809.

[4]李劍敏,萬 麗,王蓉蓉,等.銀杏葉提取物對1型糖尿病大鼠認知功能及海馬神經細胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志,2010,26(2):266-271.

[5]Meier P,Finch A,Evan G.Apoptosis in development[J].Nature,2000,407(6805):796-801.

[6]Savill J,Fadok V.Corpse clearance defines the meaning of cell death[J].Nature,2000,407(6805):784-788.

[7]Kraemer R,Baker P L,Kent K C,et al.Decreased neurotroph in TrkB receptor expression reduces lesion size in the apolipoprote in E-null mutant mouse[J].Circulation,2005,112(23):3644-3653.

[8]Mutoh T,Tachi M,Yano S,et al.Impaiment of Trk-neurotroph in receptor by the serum of apatient with subacute sensory neuropathy[J].Arch Neurol,2005,62(10):1612-1615.

[9]楊 芳,姬志娟,王蓬文,等.前體蛋白N端11肽對糖尿病小鼠腦海馬神經元神經生長因子、神經元纖維蛋白及早老蛋白1表達的影響[J].中國糖尿病雜志,2002,10(03):152-154.

[10]Chae C H,Kim H T.Forced,moderate-intensity treadmill exercise suppresses apoptosis by increasing the level of NGF and stimulating phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the hippocampus of induced aging rats[J].Neurochem Int,2009,55(4):208-213.