四氫生物蝶呤對大鼠低密度脂蛋白氧化修飾的作用及其機制探討*

朱寶亮,趙 穎,劉 景,葛 鳳△,劉樹玲,王俊杰,劉梅芳,顏 紅

(1.濟寧醫學院生理學教研室,2.生化教研室,3.藥學院,山東 日照 276826)

在遺傳或環境等諸多動脈粥樣硬化(artherosclerosis,AS)易患因素中,血清低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平升高是惟一不需要其他危險因素協同而足以誘發和推進AS發生、發展的危險因素。LDL在體內被氧化修飾為氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL,Ox-LDL)后引發的一系列復雜的病理生理過程,在AS進程中起著重要作用[1]。Ox-LDL氧化修飾是一個復雜的過程,其機制尚未充分闡明。內皮細胞表面一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)關鍵輔因子四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)被氧化分解后,NOS脫偶聯,產生活性氧(reactive oxygen species,ROS),造成機體氧化應激狀態[2]。高脂血癥(hyperlipidemia,HL)也是一種氧化應激環境。本實驗旨在探討HL氧化應激在NOS脫偶聯中的作用及其在LDL氧化修飾中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組和處理

選用8周齡雄性Wistar大鼠54只,隨機分為對照組、高脂飲食組(HL組)和高脂飲食并腹腔注射BH4組(HL+BH4組)(n=18)。HL+BH4組每周2次腹腔注射BH41 mg/kg,對照組注射等容量生理鹽水,于實驗前、實驗8周和16周時各取6只上述三組大鼠,心臟穿刺取血測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、LDL和蝶呤水平。斷頭處死,取胸主動脈再分別進行主動脈勻漿ROS、過氧化脂質水平測定。

HL大鼠模型飼料的組成是:1%膽固醇、5%豬油、10%雞蛋黃粉、84%基礎飼料;對照組大鼠進食標準大鼠飼料。大鼠每6只一籠,飼養在室溫(25±1)℃和人工光照明暗各12 h的飼養室內。各組均自由飲水。

1.2 血脂 、BH4、ROS、LDL 氧化修飾程度和脂質過氧化水平測定

1.2.1 血清TC、TG和LDL測定 全血3 000 r/min離心后取血清,用日立7170型全自動生化分析儀檢測TC、TG 和LDL。

1.2.2 LDL氧化修飾程度測定 以硫代巴比妥酸反應物(TBARS)生成量代表LDL的氧化修飾程度。取0.1 ml血清與 0.67%TBA 1.0 ml和 10%TCA 1.0 ml混合后置沸水浴15 s,4 000 r/min離心25 min,取上清于波長為532 nm處測吸光度值,以標準的四乙氧基丙烷計算含量,結果以上清液中含有的mmol/L TBARS量表示。

1.2.3 動脈過氧化脂質含量測定 用過氧化脂質的代謝終產物丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量表示。取大鼠主動脈血管段剪切成小塊并稱重,取50 mg組織放入300 μ l氧飽和的 20℃Krebs液中制成勻漿,離心取上清,按MDA試劑盒說明(硫代巴比妥酸法)用722分光光度計在532 nm處測定每管中硫代巴比妥活性物含量,再根據公式計算MDA的含量。

1.2.4 BH4及其氧化產物BH2和B的測量 取大鼠主動脈血管段剪切成小塊并稱重,取50 mg組織放入 300 μ l預冷的提取液 50 mmol/L Tris HCl(pH 7.4),1 mmol/L DTT,1 mmol/L EDTA中進行研磨,離心收集上清并測定蛋白含量,然后加入等體積比的1.5 mol/L HClO4和2 mol/L H3PO4析出蛋白,離心棄去蛋白,取上清;先在酸性條件下氧化:加10 μ l 1%碘液(2%KI配制)混勻,避光置于室溫60 min,取部分標本待測;然后于堿性條件下氧化:加入10 μ l NaOH,再加入 10 μ l 1%碘液混勻,避光置于室溫60 min;加入 20 μ l H3PO4酸化標本,離心收集上清。使用高效液相色譜法分別對酸性條件下氧化和堿性條件下氧化的標本進行測定。酸性條件下氧化的標本檢測出總生物喋呤(TB)包括BH4、BH2(二氫生物喋呤)和B(生物喋呤);在堿性條件下氧化的標本可以檢測出BH2和B;將BH2和B從總生物喋呤中除去,就是BH4含量。

1.2.5 動脈壁ROS測定 取長2 mm的主動脈環三段,放置在特制的緩沖液中。緩沖液的成分(mmol/L)包括:145 NaCl,4.86 KCl,5.7 NaH2PO4,0.54 CaCl2,1.22 MgS04,5.5葡萄糖,0.1去鐵敏和1 U/μ l過氧化氫酶。最后加入細胞色素丙(50 μ mmol/L;Sigma C-4186,Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)。分別在過氧化物歧化酶(SOD,125 U/ml)存在和不存在的情況下放置在37℃的恒溫箱中60 min。在550 nm處計算細胞色素丙的吸收量,校正背景波長540和560 nm。根據在SOD存在和不存在的條件下細胞色素丙吸收量的不同計算ROS水平。

1.3 統計學分析

采用Prism軟件分析和處理相關數據實驗結果用均數±標準差(±s)表示,用t檢驗進行顯著性分析。

2 結果

2.1 大鼠血清TC、TG和LDL水平

實驗前三組大鼠的血清TC、TG和LDL水平無明顯差異(P＞0.05)。至實驗8周和16周時,HL組和HL+BH4組血清TC、TG和LDL水平較對照組均明顯升高(P＜0.01),但HL組和HL+BH4組之間無明顯差異(P＞0.05,圖1)。

2.2 大鼠動脈勻漿ROS水平分析

實驗前三組大鼠動脈勻漿ROS水平無明顯差異(P＞0.05)。至實驗8周和16周時,HL組和HL+BH4組勻漿液中 ROS水平均明顯升高(P＜0.01);升高幅度以HL組最為明顯,實驗8周時升高186%,16周達189%。和HL組相比,實驗8和24周時HL+BH4組大鼠勻漿液中的ROS水平均明顯降低(P＜0.01),降低幅度分別為41%和39%(圖2)。

Fig.1 Changes of TG,TC and LDL in HL rats after treating with BH4

Fig.2 Changes of ROS in HL rats after treating with BH4 ROS:Reactive oxygen species;HL:Huperlipidemia;BH4:Tetrahydr-obiopterin

2.3 大鼠動脈勻漿BH4水平變化

實驗前三組BH4和TB水平無明顯差異(P＞0.05)。至實驗8周和16周時,HL+BH4組較對照組和HL組BH4水平均明顯升高(P＜0.01),提示給予外源性BH4有效提高了動脈中BH4含量;與對照組相比,HL大鼠主動脈血管勻漿中BH4含量明顯降低(P＜0.01),但總喋呤水平(TB=BH4+BH2+B)無明顯差異(P＞0.05),說明HL增加了BH4的氧化(圖3)。

2.4 BH4對大鼠血清Ox-LDL氧化修飾程度的影響

實驗前三組血清TBARS生成量(間接反映Ox-LDL氧化修飾程度)無明顯差異(P＞0.05)。至實驗8和16周時,HL組和HL+BH4組均較對照組明顯升高(P＜0.01)。與對照組相比,HL大鼠血清中TBARS生成量隨著周齡的增加有逐漸升高的趨勢,在16周齡升高幅度為22%,至24周齡增至43%。和HL組相比,上述HL+BH4組大鼠于實驗8周和16周時血清中TBARS生成量明顯降低(P＜0.01,圖4),說明BH4有阻止LDL氧化修飾的作用。F

Fig.3 Changes of BH4and TB in HL rats after treating with BH4 TB:BH4+BH2+B;BH4:Tetrahydrobiopterin

ig.4 Changes of Ox-LDL in HL rats after treating with BH4 LDL:Low density lipoprotein;HL:Hyperlipidemia;BH4:Tetrahy drobiopterin

2.5 HL大鼠動脈血管壁丙二醛水平變化

實驗前三組大鼠主動脈勻漿中的MDA水平無明顯差異(P＞0.05)。至實驗8周和16周時,HL組(7.43±1.24;8.24±1.37μ mol/L)和 HL+BH4組(6.42±0.63;7.10±0.86μ mol/L)血清MDA 較對照組(2.26±0.28;2.39±0.43μ mol/L)明顯升高(P＜0.01),但HL+BH4組較HL組MDA明顯降低(P＜0.01),說明BH4有降低動脈血管中MDA的作用(圖5)。

Fig.5 Changes of MDA in HL rats after treating with BH4 MDA:Malondialdehyde;HL:Hyperlipidemia;BH4:Tetrahydrobiopterin

3 討論

AS是全世界危害人類生命健康最嚴重的疾病之一,其患病率和死亡率均居各類疾病之首。LDL在體內被氧化修飾為Ox-LDL后引發的一系列的復雜病理生理改變是AS氧化應激學說的核心內容。Ox-LDL進入內皮細胞下組織后,不斷被內皮細胞和進入內皮下的單核細胞和巨噬細胞進一步氧化修飾為氧化程度更高的Ox-LDL—Hox-LDL(highly oxidized LDL)。Hox-LDL再被巨噬細胞吞噬,最終形成脂肪紋[3]。但內皮細胞等氧化修飾LDL的機制尚未闡明。

內皮細胞膜的穴樣凹陷中含有大量的NOS。BH4是NOS的關鍵輔因子,當BH4充足時,NOS催化L-精氨酸生成L-胍氨酸和一氧化氮(NO);而當BH4水平不足時,NOS催化L-精氨酸氧化不是生成NO,而是.O2-,此種現象稱為NOS脫偶聯[4]。NOS脫偶聯產生超氧陰離子(.O2-)在LDL氧化修飾中的作用尚不清楚。

已經證明,當LDL水平增高時,機體處于氧化應激狀態[5]。在LDL氧化過程中,氧自由基攻擊LDL中不飽和脂肪酸上的雙鍵,使之發生斷裂,先形成不飽和脂肪酸自由基,再氧化成脂過氧基,后者是一種強氧化劑[6]。

BH4是一種還原劑,易被氧化為BH2和B,即失去活性[7]。為了研究脂過氧基對NOS脫偶聯的影響,即脂過氧基對NOS的關鍵輔因子BH4的氧化作用,我們檢測了高脂血癥大鼠血清中BH4及其氧化代謝產物BH2和B的水平。結果表明,在HL大鼠實驗8和16周兩個研究時點,HL組大鼠血清中BH4水平明顯降低,而總蝶呤水平并無明顯差別。提示HL增加了機體BH4的氧化,其原因我們推測可能與HL時脂過氧基增多造成的氧化應激環境有關。而給予外源性的BH4有效提高了HL大鼠血液BH4的水平。

既然HL時,BH4低于正常,NOS脫偶聯,那么血液中ROS的生成量一定增多,為了研究NOS脫偶聯在HL氧化應激中的作用,本實驗測定了HL大鼠血清中ROS水平,結果表明在實驗8和16周時,ROS水平比對照組分別增高186%和189%,說明BH4降低導致的NOS脫偶聯在HL氧化應激狀態的形成有著重要作用。而對HL組大鼠使用BH4治療,其動脈勻漿液中的ROS水平明顯降低(P＜0.01),實驗8和16周時降低幅度分別達到41%和39%,進一步說明上述作用的存在。

本實驗還觀察了通過補充BH4,糾正NOS脫偶聯對HL大鼠脂質過氧化的影響。脂過氧基代謝生成過氧化脂質,最終大部分生成丙二醛。因此我們采用觀察丙二醛的方法,間接了解機體過氧化脂質的水平。至16周以后,HL組和HL+BH4組血清MDA較對照組明顯升高,但HL+BH4組較HL組MDA明顯降低,說明BH4有降低動脈血管中MDA的作用。其機制可能是外源性的BH4糾正NOS脫偶聯,ROS生成減少,而后者降低了LDL脂質過氧化。

高脂血癥的主要特征是血液中的LDL水平明顯增高,但血液中 LDL氧化修飾的程度并不高。LDL是一個逐漸氧化修飾的過程[8]。即LDL與內皮接觸以及進入內皮下間隙時其氧化程度不斷增高。既然高LDL時,脂質過氧化增強和NOS脫偶聯,機體處于氧化應激狀態,血液或動脈壁中的ROS和脂過氧基水平均明顯增高。二者結構中均存在游離的電子,是強氧化劑,因此它們在LDL氧化修飾中的作用應是一個值得探討的課題。我們的研究表明,HL大鼠血清中TBARS生成量隨著周齡的增加有逐漸升高的趨勢,升高幅度在16周齡時為22%,之后幅度升高逐漸增加,至24周齡增至43%。而給予外源性的BH4,糾正HL大鼠NOS脫偶聯,血液中的Ox-LDL氧化修飾程度明顯降低,提示NOS脫偶聯在LDL氧化修飾過程中具有重要作用。

綜上所述,我們做如下推理:當血液中具有一定氧化程度的Ox-LDL與內皮細胞接觸時,其中的脂過氧基氧化內皮細胞膜NOS中的BH4,NOS脫偶聯,產生大量的ROS,并繼續生成大量的脂過氧基。ROS和脂過氧基使Ox-LDL氧化修飾為Hox-LDL,并進一步氧化BH4,加重NOS脫偶聯,造成惡性化的氧化應激,這可能是LDL在內皮細胞表面氧化修飾的機制。

[1]Murphy R C,Johnson K M.Cholesterol,reactive oxygen species,and the formation of biologically active mediators[J].J Biol Chem,2008,283(23):15521-15525.

[2]Madamanchi N R,Vendrov A,Runge M S.Oxidative stress and vascular disease:2005 Duff lecture[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26(4):689-695.

[3]Kar S,Kavdia M.Modeling of biopterin-dependent pathways of eNOS for nitric oxide and superoxide production[J].Free Radic Biol Med,2011,51(7):1411-1427.

[4]Godfrey S G,Catherine A.Nutrition and Cardiovascular Disease[J].Vasc Biol,2007,27:2499-2506.

[5]Pirinccioglu A G,G?kalp D,PirincciogluM,et al.Malondialdehyde(MDA)and protein carbonyl(PCO)levels as biomarkers of oxidative stressin subjectswith familial hypercholesterolemia[J].Clin Biochem,2010,43(15):1220-1224.

[6]Tsimikas S,Tsimikas A,Alexopoulos S,et al.LDL isolated from greek subjects on a typical diet or from American subjects on an oleate-supplemented diet induces lessmonocyte chemotaxis and adhesion when exposed to oxidative stress[J].Arteri oscler Thromb Vasc Biol,1999,19(1):1222-130.

[7]王建禮,徐興華,林 娜.氧化型低密度脂蛋白與動脈粥樣硬化研究進展[J].醫學綜述,2009,15(9):1307-1309.

[8]Alkaitis M S,Crabtree M J.Recoupling the Cardiac Nitric Oxide Synthases:Tetrahydrobiopterin Synthesis and Recycling[J].Curr Heart Fail Rep,2012.