異丙腎上腺素激發試驗在大鼠酒精性心肌病模型評價中的應用*

鄒 熠,許松柏,方秋娟,王瑞幸△

(1.福建醫科大學第一臨床醫學院病理科,福州 350004;2.福建省晉江市醫院,晉江 362200;3.福建醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系,福州 350004)

臨床觀察表明,長期飲酒尤其烈性酒可造成酒精性心肌病(alcoholic cardiomyopathy,ACM)[1,2]。我國有飲酒習慣者高達3.6億人,其中2 200多萬人飲酒量達酗酒標準,但酒精性心肌病的基礎研究幾近空白。目前歐美國家已有學者建立ACM動物模型[3],但多數為高成本的自由飲模型,相應模型評價手段不甚敏銳,且無法對模型動物的心力儲備狀況進行評判。本研究采用白酒定量灌胃法建立ACM大鼠模型,將左心室插管同異丙腎上腺素激發試驗(isoprenaline provocation test,IPT)相結合,通過直接從左心室內采集大鼠左心室血流動力學參數,對其靜息狀態、激發狀態的心功能(心力儲備)行全面評價。同時,心肌標本的病理學及超微結構改變也得以觀察,以進一步揭示心臟功能學改變的形態學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性SD大鼠24只,體重200～250 g(上海斯萊克實驗動物有限責任公司,動物合格證號:SCXK(滬)2007-0005)?！岸侇^”白酒(52°v/v北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠),異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司)。RM-6240多道生理信號采集系統(成都儀器廠),PE50聚乙烯導管(外徑0.965 mm;內徑0.58 mm;美國Becton Dickinson公司)、PE10聚乙烯導管(外徑0.61 mm;內徑0.28 mm;美國Becton Dickinson公司)。

1.2 大鼠ACM模型建立

大鼠適應性飼養1周后,隨機分為正常對照組和模型組(n=12)。按晝夜時程,在穩定室溫及濕度條件下,全價顆粒飼料喂養,自由飲水。模型組大鼠定量白酒灌胃(白酒劑量20 g/(kg·d),等效給予乙醇劑量10 g/(kg·d),一天內分兩次灌入;正常對照組以蒸餾水灌胃對照。觀察動物一般狀況、進食量及體重。

1.3 基礎狀態血流動力學參數記錄

15日后,大鼠禁食不禁水12 h,以20%氨基甲酸乙酯溶液腹腔注射麻醉。于左頸外靜脈置PE10聚乙烯導管,用以給藥;于右頸總動脈插入PE50聚乙烯導管并順動脈推進,直至進入左心室,用以監測左心室血流動力學指標,記錄靜息狀態血流動力學參數。觀測指標:左心室平均收縮壓(mean left ventricle systolic pressure,mLVSP)、左心室平均舒張壓(mean left ventricle diastolic pressure,mLVDP)、左心室平均壓(mean left ventricle pressure,mLVP)、心率(heart rate,HR)、左心室最大收縮速度(maximal rise velocity of left ventricular pressure,+dp/dtmax)、左心室最大舒張速度(maximal fall velocity of left ventricular pressure,-dp/dtmax)。

1.4 異丙腎上腺素激發試驗(IPT)

記錄基礎狀態血流動力學參數后,以2 ml/kg劑量,快速注入生理鹽水,記錄5 min;后以12.5 ng/kg 、25.0 ng/kg 、50.0 ng/kg 、100.0 ng/kg 、200.0 ng/kg、400.0 ng/kg劑量分別給予異丙腎上腺素(ISO),各劑量間間隔10 min用以觀測。實驗全程使用RM-6240系統自帶軟件記錄。

1.5 左心室質量測量與形態學觀察

模型大鼠記錄血流動力學數據后迅速開胸取心,按統一標準修剪心臟周圍殘余組織后稱量左心室質量。稱量后,取心尖部分放入10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,HE染色,光學顯微鏡下行組織形態學觀察。左心室心肌組織取材,將組織塊切成1 mm大小組織塊浸于戊二醛溶液中,鋨酸固定,酒精丙酮梯度脫水,環氧樹脂包埋,超薄切片機制50 nm～70 nm超薄切片,透射電子顯微鏡觀察超微結構。

1.6 結果分析

2 結果

2.1 大鼠一般狀況

正常組大鼠無死亡,體型壯碩,食欲好;模型組大鼠死亡2只,均為實驗后期嚴重的腹脹厭食所致,存活者體形消瘦,食欲差。兩組大鼠的體重比較有顯著統計學差異(P＜0.01,表1)。

2.2 基礎狀態參數比較

使用RM-6240系統配備軟件選取所記錄波形計算各指標平均值,正常組及模型組大鼠 mLVSP、mLVDP、mLVP等血流動力學指標平均值見表2,其中模型組大鼠的±dp/dtmax、mLVSP、mLVP、HR顯著低于正常組大鼠。

Tab.1 Comparison of body weight(g,±s)

Tab.1 Comparison of body weight(g,±s)

**P＜0.01 vs control

Group n Body weight 1 d 5 d 10 d 15 d Control 12 232.57±11.09 297.97±15.11 342.85±12.46 380.58±13.67 Ethanol 10 233.81±13.28 226.63±19.15** 236.38±21.79** 243.88±20.13**

Tab.2 Hemodynamic data in resting state(±s)

Tab.2 Hemodynamic data in resting state(±s)

mLVSP:Mean left ventricle systolic pressure;mLVDP:Mean left ventricle diastolic pressure;mLVP:Mean left ventricle pressure;HR:Heart rate;±dp/dtmax:Maximal rise/fall velocity of left ventricular pressure*P＜0.05,**P＜0.01 vs control

Group n mLVSP(mmHg)mLVDP(mmHg)mLVP(mmHg)HR(beats/min)+dP/dtmax(mmHg/s)-dP/dtmax(mmHg/s)Control 12 140.18±26.03-2.55±2.05 48.98±10.58 373.60±25.02 1 0855.0±1 563.2 -7 199.7±1 211.1 Ethanol 10 108.13±6.20**-2.73±1.67 37.55±3.80* 297.20±61.49*8 272.3±1 484.5*-5 771.9±785.4*

2.3 異丙腎上腺素激發試驗(IPT)

正常組、模型組大鼠的mLVSP、mLVDP、mLVP變化規律性不大,而HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax變化較有規律?；A狀態、注射生理鹽水及各劑量ISO后,模型組大鼠HR值均低于正常組,差異有顯著統計學意義(P＜0.01);+dp/dtmax值均低于正常組,除400 ng/kg劑量外,差異有統計學意義(P＜0.05);-dp/dtmax值均低于正常組,除 12.5 ng/kg、25 ng/kg、50 ng/kg劑量外,差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。

兩組大鼠HR均隨ISO劑量升高而加大,有很好的劑量依賴關系:模型組大鼠200 ng/kg處達到峰值,加大濃度后HR基本不變獲略增;正常組大鼠HR始終隨劑量增大而升高,在所給濃度內未見峰值。模型組大鼠+dp/dtmax先升高,于12.5 ng/kg處出現最高值,之后下降,變化較為平穩;正常組大鼠+dp/dtmax值略有波動,總體仍同模型組呈現相同趨勢,但于更高劑量(25ng/kg)出現最高值。模型組大鼠-dp/dtmax的絕對值逐漸增高,在12.5 ng/kg～50 ng/kg之間基本穩定,正常組大鼠于生理鹽水處達最高值,開始注射ISO后,隨劑量增加逐漸增大,200 ng/kg處達峰,之后下降(表3)。

Tab.3 Result of IPT(±s)

Tab.3 Result of IPT(±s)

HR:Heart rate;±dp/dtmax:Maximal rise/fall velocity of left ventricular pressure;IPT:Isoprenaline prowcation test;ISO:Isoprenaline*P＜0.05,**P＜0.01 vs control

Concentration of ISO(ng/kg)HR(beats/min)+dP/dtmax(mmHg/s)-dP/dtmax(mmHg/s)Control Ethanol Control Ethanol Control Ethanol 0(NS) 381.20±19.92312.10±31.99** 12 381.4±689.09 978.9±631.1** -8 553.9±468.2-7 567.3±835.4*12.5 396.10±22.20318.40±28.91** 12 082.5±818.810 336.5±933.3** -7 954.3±669.5-7 215.9±749.9 25.0 415.60±16.51341.30±25.97** 12 446.6±731.310 172.7±923.5* -7 984.5±786.4-7 188.6±943.6 50.0 429.40±22.29341.80±35.24** 12 318.9±1 052.710 052.3±1 112.9*-7 985.6±730.2-7 175.3±1 129.4 100.0 433.50±24.10350.00±25.48** 11 639.4±888.99 651.1±1 043.8* -8 225.7±1 018.4-6 268.5±1 037.1*200.0 441.00±30.93352.00±18.24** 11 429.3±692.59 634.4±1 202.4* -8 764.9±840.3-6 417.5±1 383.1*400.0 449.00±28.61350.50±24.77** 10 890.0±1 190.59 452.6±799.3* -7 889.9±884.2-6 175.3±1 115.3*

2.4 形態學觀察

模型組大鼠心臟體積明顯大于正常組大鼠心臟,心腔擴大,室壁軟癟變薄、張力低(圖 1A),心室質量(HW)亦低于正常組,行雙尾t檢驗分析顯示差異有統計學意義(P＜0.05),心重量體重量比(HW/BW)稍高,但尚無統計學意義(表4)。

Tab.4 Comparison of heart weight(±s)

Tab.4 Comparison of heart weight(±s)

HW:Heart weight;BW:Body weight*P＜0.05 vs control

Group n HW(g) HW/BW Control 12 1.1303±0.0774 0.00297±0.00014 Ethanol 10 0.7292±0.0609* 0.00299±0.00019

病理切片顯示,模型組大鼠左室壁變薄,心肌充血,其間有灶性出血;肌束疏松紊亂,有斷裂,壁間血管擴張明顯,血管周圍炎癥細胞浸潤,且有少量炎癥滲出;內膜面心肌細胞擴大,輪廓不清、胞質疏松,部分細胞胞漿淡染,細胞核有畸形出現。乳頭肌細胞脂肪變性,近內膜面細胞胞漿水腫、顆粒狀,其中有空泡生成(圖1B、D)。正常組大鼠心肌縱切面可見細胞排列規整,大小一致,核居中、細長。橫切面心肌排列有序,胞質均勻,胞核比例正常(圖1C、E,圖1見彩圖頁Ⅰ)透射電子顯微鏡下,正常組心肌細胞超微結構線粒體眾多,聚集在一起并含有密集的嵴;肌原纖維排列規整,無斷裂,其A帶、I帶與H帶和M線、Z線清晰可見(圖2A)。模型組大鼠線粒體變形腫脹,可見聚集融合;嵴紊亂溶解、模糊不清。肌原纖維排列不規整,有斷裂、溶解發生。A帶、I帶、與H帶、M線、Z線模糊不清(圖2B)。

Fig.2 Electronograph of Myocardium(×12.5k)

3 討論

酒精長期作用于飲酒者心臟,心肌細胞凋亡丟失而導致有效收縮單位數量減少[4],心肌發生重塑、纖維化[5]致使室壁順應性降低,同時細胞內細胞器功能受損[6]、收縮蛋白破壞[7]、鈣離子相關蛋白紊亂[8]將進一步削弱心肌細胞的收縮能力。另一方面,酒精亦可通過神經內分泌因素介導而對心臟產生間接毒害[9],導致心功能和(或)代謝發生改變。本研究中,大鼠經過15日高度酒灌胃,已出現心肌收縮力減退、心排量降低、心臟擴大、心肌細胞密度降低、線粒體融合腫脹、嵴紊亂等現象,其功能學及形態學改變均符合臨床[6]。酒精性心肌病大鼠模型已基本建立。

在心血管生理功能的評價上,本研究將左心室插管同異丙腎上腺素激發試驗相結合,前者以其敏感性和準確性著稱,可直接采集并實時定量分析各種血流動力學參數,同超聲心動圖方法相比,更利于監測心臟功能學的微小變化。通過該項技術,本實驗不僅觀察到靜息狀態下模型組大鼠左心室最大收縮速度、左心室最大舒張速度、左室平均收縮壓及心率的明顯下降,同時也發現了左室平均舒張壓的略微升高。上述數據一方面提示了模型組大鼠心肌質量下降,心臟收縮能力下降;另一方面也說明了左心室壁順應性減低,心臟舒張、血液充盈功能受到影響。

在獲得靜息狀態模型組大鼠心血管生理數據的基礎上,為了對其心力儲備進行進一步考察,本研究采用了異丙腎上腺素激發試驗(IPT)。異丙腎上腺素(ISO)為作為常用的非選擇性β受體激動劑,注射后將導致大鼠心率、心肌收縮力、心排出量發生正性改變,引出心肌潛在的舒縮能力,從而對其心力儲備進行評價。模型組大鼠注射ISO后,雖各項指標有所上升,但無法超越正常組,且波形大多不穩定,體現了其心力儲備以及整體調節能力的下降。所有監測數據中,心率和左心室最大收縮速率為劑量依賴性關系最好的兩項監測指標,兩組動物的相關數據顯示出較為相似的變化規律,提示模型組大鼠尚能完成心力儲備的釋放。但是,模型組大鼠在較低濃度ISO的刺激下便達到各觀測指標峰值,且各峰值顯著低于正常組大鼠,說明其心力儲備量明顯減少,在較低ISO濃度時心力儲備即被耗竭,而無法滿足更高濃度ISO刺激下更強心臟收縮的要求。同基礎狀態相比,ISO激發下,兩組大鼠血流動力學參數差異也更為明顯,各指標差距得以大幅放大,部分原正常指標出現異常,更為直觀地顯現了模型組大鼠心臟舒縮功能的下降及潛在的心功能異常。此外,本實驗還觀察到,在IPT初的生理鹽水注射中,正常組大鼠的心臟表現出更為強烈的生理反應。這個現象很好的說明了模型組大鼠心血管系統對血容量改變的反應能力下降,證明了模型鼠心血管整體調節機制啟動或作用效果(心肌舒縮能力改變)的異常。

將以上功能學參數結果同形態學改變比較分析,可發現兩者間存在著較好的一致性:模型大鼠心肌細胞壞死、退行性變,心肌質量下降,導致心臟外在及儲備收縮能力下降;心肌細胞肥大和(或)增生,造成左心室壁順應性減低,影響心臟舒張功能;同時心室擴張,心肌收縮初長度加大,使得心肌收縮時難以處于最適初長度范圍。在電鏡片中,心肌細胞肌原纖維斷裂、線粒體受損嚴重,致使心肌收縮的結構基礎受到破壞、細胞能量供應銳減,進一步減弱心臟舒縮能力和心力儲備,降低每搏輸出量,加重心功能紊亂。此外,值得指出的是,研究中模型組大鼠靜息與激發狀態下心率均低于正常組大鼠,這一現象是慢性酒精攝入所特有的,區別于急性酒精作用的正性心率效應[10]。

綜上,本研究采用酒精灌胃法成功建立了ACM大鼠模型,并通過左心室插管、IPT、病理及超微結構觀察等多種方法對模型進行了較為全面的評價。其中IPT作為一種便捷手段,能夠有效激發受試動物在麻醉狀態下的心力儲備,并予以定量考察。該法對組間心功能指標差異具放大效應,可使各組間參數差異增幅,利于觀察和比較分析;同時,其還可顯示靜息狀態下難以偵測的心功能異常,使輕微心功能下降得以更有效暴露,特別利于疾病早期模型的評價,對其他心臟病模型亦有推廣應用價值。

衷心感謝福建醫科大學附屬第一醫院病理科張聲主任醫師、福建醫科大學病理學系張文敏教授、福建醫科大學醫學技術與工程學院黃焱教授在文稿修改與病理學觀察方面所給與的幫助、指導,感謝何瑞嵐老師贈予的相關實驗資料。

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