腦源性神經營養因子拮抗β淀粉樣蛋白所致大鼠在體海馬長時程增強的傷害*

李清山,楊 威,潘艷芳,閔 婕,張 吉吉,高慧中,祁金順△

(1.山西醫科大學第二臨床醫學院,2.山西醫科大學生理學系、細胞生理學省部共建教育部重點實驗室,太原030001;3.中國醫學科學院北京協和醫學院基礎學院醫學分子生物學國家重點實驗室,北京 100005)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種原發性神經退行性疾病。據《世界阿爾茨海默病報告》(World Alzheimer Report)統計,2010年全球約有3560萬AD患者[1]。AD的典型病理特征之一是腦內出現高密度的老年斑,其主要成分是由39～43個氨基酸組成的β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)。目前,Aβ的神經毒性已被廣泛報道[2]。長時程增強(long-term potentiation,LTP)是突觸前神經元受到快速重復性刺激后出現的突觸后反應持續性增強現象,海馬LTP已經被廣泛認為是理想的反映突觸可塑性的功能性指標和學習記憶電生理細胞模型。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是腦內神經營養因子的一種,其主要分布在海馬、大腦皮層和紋狀體等部位[3]。Phillips HS等[4]1991年已證實,AD患者海馬內存在著大量的老年斑,同時海馬內的BDNF和BDNF mRNA的含量有明顯降低。以后,陸續有報道表明,BDNF能保護大鼠免受應激刺激誘導的空間學習記憶傷害[5];BDNF對AD模型小鼠行為學也有明顯的保護作用[6]。近年來,Zheng Z等人[7]的實驗表明,Aβ還能抑制BDNF的表達 。這些實驗結果說明,BDNF可能參與AD時的神經元變性及其代償機制。然而,保護海馬LTP免受Aβ傷害的研究仍然十分有限;BDNF對AD動物行為學保護作用的電生理機制還不清楚;BDNF是否影響海馬突觸傳遞及其可塑性,是否能夠阻止Aβ引起的海馬LTP損傷尚未見系統報道。本實驗通過記錄在體大鼠海馬CA1區場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potentials,fEPSPs)和反映突觸可塑性的LTP,研究了BDNF拮抗Aβ的神經保護效應,旨在為AD的預防和治療尋找新的、有效的腦內靶點。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

健康雄性SD大鼠由山西醫科大學實驗動物中心提供,體重250～ 300 g。Aβ25-35(Sigma公司)和BDNF(北京愛迪博生物科技有限公司),均用生理鹽水溶解。36只大鼠隨機分為六組(n=6):分別為對照組 、2 nmol Aβ25-35組 、0.1 μ g BDNF 組 、0.02 μ g BDNF+Aβ25-35組 、0.1 μ g BDNF+Aβ25-35組和 0.5 μ g BDNF+Aβ25-35組。每組給藥體積均為 2 μ l,對照組給予2 μ l的生理鹽水。

1.2 手術及電極定位

25%烏拉坦(1.5 g/kg)腹腔注射麻醉大鼠。在雙臂數字式腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司,型號:68004)上固定大鼠,暴露顱骨,以前囟點(Bregma)為基準鉆孔。在腦立體定位儀和微推進裝置引導下,將自制的不銹鋼給藥導管插入左側海馬CA1區中心部位(Bregma后2.8mm,中線旁開2.0 mm,深度3.0 mm);將自行設計的平行綁定電極同步垂直插入大鼠左側海馬部位,其中刺激電極和記錄電極尖端分別定位于海馬Schaffer側支(Bregma后4.2 mm,中線旁開:3.8 mm)和CA1區放射層(Bregma后3.8 mm,中線旁開:2.9 mm)。

1.3 給藥及LTP記錄

電極到達預定的刺激/記錄部位后,用電刺激器(日本光電,SEN-3301)和刺激隔離器(日本光電,SS-102J)每 30 s給予 Schaffer側支一個波寬為50 μ s、強度為100～150 μ A 的直流電刺激誘發 fEPSPs,記錄基礎fEPSPs。刺激強度選用最大反應刺激強度的30%～40%。給藥前,記錄30 min基礎fEPSPs以確保基礎性突觸傳遞的穩定性;用微量注射泵(KD Scientific,Inc,KDS310 Plus,USA)和5 μ l微量注射器經導管以 0.1 μ l/min 的速度將藥物(Aβ25-35、BDNF、BDNF+Aβ25-35)注入海馬。其中,聯合給藥組BDNF預處理15 min后再給予Aβ25-35;對照組注射等體積的生理鹽水。給藥后,繼續記錄30min基礎fEPSPs,以觀察藥物對基礎性突觸傳遞的影響;之后,施加3串頻率為200 Hz的高頻刺激(high-frequency stimuli,HFS)誘發LTP。每串HFS包含20個脈沖,3串HFS的間隔為30 s;HFS后,連續記錄1 h fEPSPs以觀察LTP的持續性變化。

1.4 數據分析

LTP主要考察fEPSPs的幅度變化。先將每只大鼠fEPSPs的幅度標化,即以其基礎fEPSPs的幅度值作為100%,計算HFS前后各時間點fEPSPs幅度改變的百分比。之后再將同組動物相同時刻的幅度百分比進行平均,以均數±標準差(±s)表示。HFS后fEPSPs幅度值增加超過50%為LTP的成功誘導。統計學分析采用SPSS軟件,通過重復測量方差分析(repeated measures ANOVA)計算HFS后相同時刻各組fEPSP之間的差異。

2 結果

2.1 海馬內單獨注射Aβ25-35或BDNF不影響CA1區基礎性fEPSPs

為了判斷Aβ25-35和 BDNF本身是否影響海馬CA1區的基礎性突觸傳遞,我們比較了給藥前15 min和給藥后5 min、15 min及30 min四個時刻的基礎性fEPSPs的幅度。Aβ25-35組(2 nmol)四個時刻的基礎性fEPSPs的幅度分別為99.6%±0.5%、100.1%±1.1%、101.0%±0.6%和100.5%±0.7%;BDNF組(0.1 μ g)四個時刻的基礎性fEPSPs的幅度分別為100.5%±0.8%、99.3%±1.1%、98.7%±1.4%和98.8%±0.8%。統計學分析表明,海馬內分別注射Aβ25-35和BDNF對海馬CA1區基礎性fEPSPs均沒有顯著影響(P＞0.05)。

2.2 HFS成功誘導了在體大鼠海馬CA1區突觸易化和LTP

為了觀察腦內深部的HFS能否在大鼠CA1區成功誘導LTP,我們在記錄基礎性fEPSPs的基礎上,給大鼠Schaffer側支施加了一組HFS。對照組HFS引起的fEPSP的幅度逐個增加,顯示明顯的突觸傳遞易化現象(圖1A)。HFS結束后的即刻,對照組由測試刺激引起的fEPSPs幅度變化值則由HFS前的100%增加到202.5%±2.0%。一個小時后,fEPSP仍然維持在155.8%±3.1%(圖1B)。

Fig.1 Three trains of HFS successfully induced synaptic facilitation and LTP in hippocampal CA1 region

2.3 海馬內注射Aβ25-35明顯抑制了海馬LTP的誘導和維持

在成功誘導在體海馬LTP的基礎上,我們觀察了海馬內注射Aβ25-35對海馬LTP誘導和維持的影響。海馬CA1區急性單獨給予 2 nmol Aβ25-35后,與對照組相比,HFS引起的LTP明顯受到抑制。HFS刺激后即刻、30 min和60 min時,單獨給予Aβ25-35組的fEPSPs幅度分別為156.4%±3.8%、132.1%±4.1%和129.5%±2.8%,明顯低于對照組的202.5%±2.0%、158.2%±4.8%和155.8%±3.1%(P＜0.01,圖2)。

2.4 海馬內注射0.1 μ g BDNF不影響 CA1區 LTP的誘導和維持

為了研究BDNF的神經保護效應機制,我們首先觀察了腦內注射BDNF本身是否對海馬LTP產生影響。與對照組相比,海馬CA1區急性單獨給予0.1 μ g BDNF后,基礎突觸傳遞以及HFS誘發的LTP均沒有明顯改變,兩組fEPSP幅度隨時間的變化幾乎重疊。HFS刺激后即刻、30 min和60 min時,單獨給予BDNF組的平均fEPSPs的幅度值分別為195.2%±3.2%,160.8%±3.4%和154.7%±1.5%,與對照組三個時刻的fEPSPs幅度值相比,均無顯著性差異(P＞0.05,圖2)。

Fig.2 Effect of A β25-35and BDNF injection on the hippocampal LTP(±s,n=6)

2.5 BDNF預處理劑量依賴性阻斷Aβ25-35對海馬LTP的抑制效應

為了證實BDNF是否具有保護海馬LTP免受Aβ傷害的作用,我們觀察了BDNF預處理后Aβ25-35(BDNF+Aβ25-35)的效應。與單獨給予Aβ25-35相比,HFS 后 fEPSPs平均幅度在0.1 μ g BDNF+Aβ25-35組有明顯提高。HFS刺激后即刻、30 min和60 min時,BDNF+Aβ25-35組的fEPSPs平均幅度分別為177.6%±4.8%,148.7%±2.8%和145.7%±3.1%,與單獨給予Aβ25-35組相比,幅度差異具有統計學意義(P＜0.01,圖3)。

為了進一步證實BDNF保護海馬LTP免受Aβ傷害的作用是否具有劑量依賴性,我們又觀察了較低劑量和較高劑量的BDNF預處理效應(0.02 μ g BDNF+Aβ25-35;0.5 μ g BDNF+Aβ25-35)。與單獨給予Aβ25-35相比,0.02 μ g BDNF預處理組沒有改善損傷的LTP,HFS刺激后即刻、30 min和60 min時,fEPSPs平均幅度分別為159.4%±2.8%、136.5%±4.4%和131.4%±2.7%(P＞0.05);而 0.5 μ g BDNF 預處理組明顯改善了LTP的傷害,HFS刺激后的三個時刻點,fEPSPs平均幅度分別為 185.5%±2.3%、157.8%±2.3%和152.3%±3.2%(P＜0.01)。三個聯合給藥組比較的結果顯示,中等劑量(0.1 μ g)BDNF和較高劑量(0.5 μ g)BDNF預處理組與較低劑量(0.02 μ g)組相比,幅度差異在三個不同的時刻均具有統計學意義(P＜0.01,圖3)。

Fig.3 BDNF dose-dependently prevented against Aβ25-35-induced impairment of hippocampal LTP(±s,n=6)

3 討論

Aβ在腦內的積聚及其神經毒性作用被認為是造成AD的一個主要致病因素[2]。AD轉基因鼠實驗發現,Aβ主要積聚在海馬和皮層,同時還存在AD樣的其它病理改變以及空間記憶的損害。有研究表明,AD病人腦內存在有突觸傳遞和突觸可塑性的功能障礙;在體及離體動物實驗也均證實,Aβ對海馬LTP具有明顯的傷害作用。然而,目前Aβ抑制海馬LTP的在體或離體實驗大多經腦室給藥或腦片灌流進行。這些實驗本身需要使用較多的藥物,成本較高;同時,進入腦室后Aβ可廣泛作用于腦的不同部位,很難說明其對海馬突觸傳遞的直接效應。本研究在記錄海馬CA1區fEPSPs的基礎上,將微量(2 nmol)的Aβ25-35直接注射到海馬CA1區,觀察了局部給予Aβ25-35對海馬突觸傳遞的直接效應。我們發現,急性注射Aβ25-35不影響基礎性fEPSPs,但能較快地抑制LTP的誘導與維持。這表明,海馬內本身沉積的Aβ可以直接抑制海馬LTP。

BDNF是人體內的一種神經營養因子,具有保護神經元、維持神經突起生長和保障突觸傳遞正常進行等重要作用。研究表明,BDNF在海馬表達水平最高[3],對海馬LTP的維持起關鍵作用,可影響人和動物的學習與記憶功能。進一步研究發現,AD患者海馬中不僅沉積有大量的以Aβ為主要成分的老年斑,還出現BDNF含量的明顯降低;低聚體Aβ1-42也能使海馬BDNF的含量明顯降低[7]。這提示,Aβ可能通過傷害BDNF的表達及其功能,從而加重AD患者腦內神經元的變性,降低突觸可塑性,并最后影響認知記憶功能。當然,也有報道表明,AD老年斑內存在BDNF免疫活性物質;側腦室急性輸入Aβ25-35可以使大鼠海馬BDNFmRNA表達明顯增加。這或許是大鼠對抗Aβ25-35損傷的一種自我保護機制,說明BDNF可能參與Aβ所致神經元損傷的代償作用。Zhou等人[6]的研究表明,BDNF和Aβ聯合給予可明顯改善Aβ所致的小鼠海馬神經元數量下降和空間學習記憶能力傷害。然而,BDNF改善腦認知功能的電生理機制特別是對在體海馬LTP的研究尚不多。已有實驗表明,BDNF基因敲除小鼠的LTP出現明顯抑制,外源性補充BDNF后,被抑制的海馬LTP能恢復到正常大小。本實驗的主要目標是以在體海馬LTP為觀察對象,研究BDNF拮抗Aβ的神經保護效應。為了避免較大劑量的BDNF引起基礎性fEPSPs自發增大[8],我們在聯合給藥組中選用的最大劑量BDNF為 0.5 μ g。實驗結果表明,海馬 CA1區直接給予BDNF不影響基礎性fEPSPs,也不影響海馬CA1區 LTP的誘導與維持,但給予0.1 μ g和0.5 μ g的 BDNF 預處理后,Aβ25-35引起的大鼠在體海馬LTP的抑制能夠被有效阻斷,并在一定范圍內呈現出劑量依賴性效應。這一結果表明,BDNF預處理能有效拮抗Aβ25-35對海馬神經元所造成的神經毒性作用,維持海馬正常的突觸傳遞。

盡管BDNF保護海馬LTP和記憶行為免受Aβ傷害的分子機制仍然有待進一步深入研究,但據目前報道,Aβ引起海馬突觸可塑性發生障礙的機制可能與Aβ抑制CaMKII的激活和減弱AMPA受體磷酸化有關;相反BDNF對LTP的保護作用可能是通過與TrkB受體結合后,促進了CaMKII的自身磷酸化和AMPA受體的磷酸化,進而改善了突觸傳遞可塑性[9]。另外,Vitolo等在小鼠海馬腦片LTP的實驗中證實,Aβ1-42對LTP誘導的抑制作用可能是通過抑制腺苷酸環化酶的活化,使細胞內cAMP水平降低,蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)失活,最終使轉錄因子CREB(cAMP responsible element binding protein)不能磷酸化而啟動轉錄所致。BDNF和TrkB的結合可以激活PKA,從而磷酸化CREB并啟動下游基因的表達,最終使得內源性Aβ減少,改善已經損傷的學習記憶功能,以上部分推論已被Caccamo等所證實[10]。

總之,本實驗首次利用記錄在體大鼠海馬CA1區LTP的方法,探討了海馬CA1區局部給予外源性BDNF對突觸傳遞可塑性的保護效應。結果表明:海馬局部注射微量的Aβ25-35可造成明顯的LTP傷害;不同濃度的BDNF預處理則能劑量依賴性阻斷Aβ25-35引起的LTP抑制,對突觸傳遞可塑性具有明顯的保護作用。因此,本實驗不僅為BDNF神經保護作用提供了電生理學方面的支持性證據,也提示腦內BDNF水平的適當上調可能有助于防止AD患者早期出現的認知功能下降。

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