多基因SNP位點及多種危險因素與老年漢族冠心病的關聯分析*

孫玉發,曹 劍,李曉利,,范 利△,王 強,王 卉,張 紅,楊 莉,張 帆

(1.解放軍總醫院南樓心血管一科,北京 100853;2.解放軍第309醫院干部病房;3.國防大學第一干休所;4.八一隊干休所,北京 100091)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease,CHD)在老年人群中高發,是老年疾病的一種。由于受到社會經濟水平、生活方式以及老齡化進程加速的影響,冠心病迅速成為中國老年人群的主要疾病以及主要死亡原因,同時與冠心病相關的危險因素較50年代發生了明顯變遷。CHD確切的病因并未完全闡明。遺傳易感性與危險因素交互作用是CHD發病的主要機制。CHD歸屬于多基因遺傳疾病,因此采用高通量基因學或全基因組學方法研究CHD遺傳易感性必將成為研究CHD基因學的趨勢[1]。多基因遺傳疾病的特點在于多種微效基因存在累加效應。推測多種微效基因的改變,導致某些與CHD病因相關分子的結構以及數量改變,使得與危險因素包括可控制因素(比如高血壓、吸煙、高脂血癥、生活方式等)與不可控制因素(年齡、性別、CHD家族史等)的交互作用模式發生改變,從而導致CHD的發生與發展。

基于以上的認識,我們研究了影響CHD發生的15種常見危險因素以及10種易感基因。借助新型高通量的基因多態性分型研究技術,采用候選基因方法,篩選了10種與已有報道與老年疾病比如與糖尿病、冠心病、高血壓、老年性癡呆、高脂血癥、動脈血栓及栓塞等疾病相關的基因,包括:血管緊張素轉化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE),血小板糖蛋白(glycoprotein Iba,GPIba),亞甲基四氫葉酸還原酶(mthylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR),血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1),微管相關蛋白tau(microtubule-associated protein tau,MAPT),血小板糖蛋白6(platelet glycoprotein 6,GP6),纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor,PAI-1 gene),環氧化酶(cycloxygenase-1,COX-1),血小板ADP受體(purinergic receptor P2Y1,P2Y1),抗凝血酶(antithrombin III,ATIII),共10種基因11單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)與CHD關聯性進行了分析。

1 材料及方法

1.1 研究方法

采用病例-對照研究方法。

1.2 研究對象

人群來自于2008年4月～2010年7月解放軍總醫院、解放軍309醫院、海軍總醫院以及25個軍隊干休所共246例老年漢族冠心病漢族患者,同時入選老年非冠心病患者185例作為對照組。符合其中一項診斷為冠心病:(1)慢性穩定型心絞痛患者;(2)陳舊性心肌梗死患者;(3)經皮冠狀動脈介入術后患者或外科冠狀動脈搭橋(CABG)術后患者;(4)年齡≥65歲的漢族人群。排除標準:不能配合調查,不愿參加調查者。本研究通過中國人民解放軍總醫院科學和倫理審查委員會批準;所有病人提供書面知情同意后方可入選。

1.3 問卷調查

主要內容包括:年齡、性別、民族、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高脂血癥等。

1.4 血樣標本采集

抽取大約10 ml靜脈血。檢測指標包括:同型半胱氨酸,氨基末端腦鈉肽前體,超敏C反應蛋白,抗凝血酶III,膽固醇,甘油三酯,高密度脂蛋白,低密度脂蛋白等。

1.5 DNA提取和SNP檢測

DNA提取采用傳統采用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)方法。利用Sequenom系統利用激光解吸附電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)進行SNP基因分型。設計3條引物,2條用于PCR,用于目的基因延伸,1條引物(探針)用于單堿基延伸,針對SNP突變位點,突變位點檢測是通過質譜儀對分子質量的不同進行檢測,利用特定軟件,設計不同分子質量的引物探針,不同的SNP位點在質譜圖上會形成不同的峰,彼此之間無重疊,從而根據分子質量之間的差異,完成多重SNP檢測。具體根據SNP位點序列,采用Sequenom公司的Assay Design 3.1軟件進行引物設計。引物情況見表1。SNP_ID為SNP序列號;1st-PCRP和2nd-PCRP為PCR擴增引物,DIR為擴增方向,F指PCR擴增的為SNP位點,R指PCR擴增的為SNP位點互補鏈,對標識R的SNP,在結果分析時需要置換成SNP位點對應位點堿基。Mass為探針分子質量;probe為單堿基延伸引物(探針)。SNP檢測采用美國Sequenom系統SNP分型技術,具體見Sequenom系統SNP分型技術操作手冊。擴增效率大于75%的樣本,納入統計學分析。

1.6 統計分析

SPSS 13.0完成統計學分析。計數資料采用χ2檢驗,正態分布計量資料采用成組t檢驗,資料描述采用平均數加標準差(±s),偏態計量資料采用秩和檢驗方法檢驗,資料描述采用中位數M,變異范圍用5%分位數到95%分位數(P5-P95)描述。冠心病危險因素篩查分析是將單因素檢驗P＜0.01的參數,納入多因素非條件性Logistic回歸法。SNP位點等分析采用:(1)應用haploview 4.2軟件對總體樣本進行哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg,H-W)分析;(2)應用THESIS軟件對病例對照組基因型頻率進行χ 2關聯分析;(3)在基因型/頻率關聯分析基礎上,陽性結果應用在線軟件SNPstats進行非條件Logistic回歸模型評估基因型與CHD發生風險相關程度,并計算優勢比(OR)及95%可信區間(CI)。

Tab.1 Primers and probes in 11 SNPs of 10 genes

2 結果

2.1 人口學特征與危險因素分析

表2所示共計調查了431例老年漢族患者,冠心病246例,非冠心病185例,冠心病占總數57.08%。單因素分析冠心病患者與非冠心病患者相比,性別、吸煙、飲酒、糖尿病、高脂血癥、同型半胱氨酸、超敏C反應蛋白、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白,統計學無明顯差異(P＞0.05)。但年齡、高血壓、抗凝血酶III、氨基末端腦鈉肽前體、低密度脂蛋白,在冠心病與非冠心病患者中存在統計學差異(P＜0.05)。將單因素分析P＜0.10的參數包括:年齡、高血壓、高脂血癥、氨基末端腦鈉肽前體、抗凝血酶III、膽固醇、低密度脂蛋白納入非條件Logistic回歸二次分析。結果顯示增齡、高血壓為冠心病危險因素,P值分別是0.00,0.05和0.02,95%CI分別為(1.01,1.05),(1.05,2.84)和(1.08,2.74),ATIII為冠心病保護因素,ATIII在非CHD患者中高表達(107.02%±14.09%vs103.27%±13.91%),P值為0.00,CI為(0.96,0.99)(表3)。

2.2 SNP與冠心病關聯分析

haploview 4.2對10個基因11個SNPs位點進行HW平衡檢驗,所有位點符合HW平衡,所有位點擴增效率大于75%,全部納入SNP與冠心病相關分析。應用THESIS軟件對病例對照組基因型頻率進行χ2關聯分析結果提示GP1BA rs6065(524C/T),MTHFR rs1801133(677C/T),HO-1 rs2071746(-413A/T),MAPT rs242557(A/G),ACE rs4332(547C/T),GP6 rs1613662(13254T/C),PAI-1 rs2227631(-844 G/A),COX-1rs1330344(1676C/T)和P2RY1 rs1065776(893C/T)與冠心病無明確相關(表4)。而GP1BA rs2243093(-5T/C)與冠心病呈現相關趨勢,P=0.06接近0.05,CC基因型是冠心病發生危險因素,OR=2.83 CI=(1.03,7.76)。ACE rs4332(547C/T)與冠心病明確相關,P=0.01。野生型CC為CHD危險因素,OR=1.55 CI=(1.04,2.31);ATIII rs2227589(893C/T)與CHD相關,P=0.01,CC野生型為CHD保護因素,OR=0.56,CI=(0.38,0.82)。

3個陽性位點GP1BA rs2243093(-5T/C),ACE rs4332(547C/T),ATIII rs2227589(893C/T)應用在線軟件SNPstats進行非條件Logistic回歸模型評估與CHD相關性(表5)。結果顯示:GP1BA rs2243093(-5T/C),與TT+CT基因型相比,突變CC基因型是CHD發生危險因素,P=0.029,OR=2.83,CI=(1.03,7.76),經年齡、高血壓,高脂血癥、ATIII三個冠心病危險因素校正后,突變CC基因型是CHD的危險因素,P=0.014;ACE rs4332(547C/T),雜合型TC基因型是CHD的保護因素,P=0.003,OR=0.51,CI=(0.34～0.77),純合子TT和CC是CHD的危險因素。經年齡、高血壓,ATIII三個CHD危險因素校正后,P=0.001,OR=0.51,CI=(0.34～0.77)。ATIII rs2227589(893C/T),突變基因T攜帶者CT+TT基因型是CHD的危險因素,P=0.003,OR=1.79,CI=(1.22～2.63),經年齡、高血壓、高脂血癥、ATIII校正后,P=0.006,OR=1.76,CI=(1.17～2.63)。

Tab.2 Demographic details for the patients

Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of clinical risk factors with CHD

Tab.4 Correlation analysis of 11SNPs of 10-plex genes with CHD

Tab.5 Correlation analysis of SNPs of GP1BA,ACE,ATIII with CHD by logistic regression

3 討論

盡管CHD發病具有普遍性,但是,受到不同地域、不同人種、性別、年齡,不同生活方式等的影響,CHD發病有其自身的特點。文獻陸續報道的CHD危險因素已有300多個,包括了性別、年齡、吸煙、家族史、血脂異常、高血壓、糖尿病、凝血和纖溶功能異常,感染和炎癥反應、氧化應激,同型半胱氨酸等,但年齡、高血壓、高脂血癥仍舊是CHD共同的危險因素[2]。動脈粥樣硬化是CHD發病的病理基礎,動脈粥樣硬化起自少兒期,30～49歲冠狀動脈粥樣硬化急劇進展,中老年之后逐漸出現CHD的癥狀。在我們的研究當中,顯示增齡、高血壓、是中國老年漢族患者CHD發病的危險因素,而吸煙、肥胖、糖尿病不是構成中國老年漢族患者CHD的主要環境危險因素。

CHD是一種多基因遺傳疾病,CHD關聯基因對CHD風險預測作用不亞于傳統的危險因素,CHD關聯基因的揭示發揮著推動 CHD個性化治療的作用[3]。推測大約有500個基因參與了冠心病的發生發展[4]。CHD遺傳易感性存在人種的差異性。某些CHD易感位點可能在高頻出現某一人種,從而構成主要的致病基因。單一致病基因對CHD貢獻不大,多種致病基因累積是CHD發病的遺傳學基礎。因此,研究中國人群CHD遺傳易感性,必須首先明了對CHD哪些基因及易感位點對中國人群CHD構成危害。10種基因11SNP與CHD關聯分析研究結果提示,中國老年患者存在CHD三種易感性基因以及對應的3個SNPs位點,分別是GPIba(rs2243093),ACE(rs4332)和ATIII(rs2227589)。而已有報道與CHD相關的基因或位點GPIbars6065,GP6 rs1613662,HO-1 rs2071746,MTHFR rs1801133,PAI-1 rs2227631卻與中國老年CHD無關聯。COX-1和P2RY1與參與阿司匹林抗血小板作用,本研究中未發現 MAPT、COX-1和 P2RY1 SNP位點 rs7831,rs242557,rs1330344和rs1065776 CHD關聯。

血小板糖蛋白Iba(glycoprotein Iba,GPIbα)是血小板表面vWF因子受體亞單位,GP Iba-Ibβ-IX-V共同構建成vWF因子受體,該受體復合物與vWF結合位點位于GP IbaN-端結構域,vWF因子-GP Ib/IX/V交聯參與動脈血栓性疾病形成[5],GPIba rs2243093(-5T/C),T/C多態性位于啟動子區kozak序列,有報道C等位基因攜帶者,血小板GPIb-IX-V在體外和體內受體表達增加。我們的研究結果顯示了GPIba rs2243093(-5T/C)與CHD相關。而另一個GPIba rs 6065(2217C/T)引起位于vWF受體結合域第145位蘇氨酸/蛋氨酸(Thr/Met)改變,同樣有報道rs 6065(524C/T)與動脈血栓性疾病相關聯,我們的結果不支持GPIbαrs 6065與CHD相關聯。

抗凝血酶III(antithrombin,ATIII)反映機體抗凝血的功能。CHD患者存在不同程度的高凝狀態。1991年,俄國Koshkin IuP等研究發現具有CHD家族史的患者,發現抗凝血酶III活動度可以作為一個CHD遺傳易感性的一個標志。我們研究結果顯示:無論從蛋白水平以及從基因水平上,ATIII與 國人CHD相關聯。在蛋白水平上,ATIII在非CHD人群中呈現高表達(107.02%±14.09%),在CHD中呈現低表達(103.27%±13.91%)。在基因水平上,發現ATIII rs2227589(893C/T)與國人CHD相關聯。純合子野生型CC基因型是CHD保護因素,在非CHD患者中出現頻率為58.92%,在CHD患者中出現頻率為44.49%。除外同動脈血栓關聯之外,另外有報道ATIII rs2227589(893C/T)突變引起抗凝血酶活性減低與深靜脈血栓形成相關聯[6]。

血管緊張素轉化酶(angiotensin-convertion enzyme,ACE)ACE插入/缺失性(I/D)多態性基因多態性與CHD相關聯,報道頗多。D突變體攜帶者,ACE表達上調[7],腎素-血管緊張素-醛固酮軸活性增加,包括動脈硬化、心肌梗死、阿爾茨海默病等風險增加。我們在研究中發現另一個ACE基因多態性位點rs4332(547C/T)與CHD相關聯。rs4332位于內含子區域,雜合型CT基因型是冠心病的保護因素,而CC+TT基因型則是CHD危險因素。推測位于內含子區域的突變位點不影響ACE分子結構,可能通過影響基因剪切、拼接,從而影響ACE轉錄效率,其作用機理,有待于進一步深入探索。

本研究初步探索老年CHD患者發病的部分環境危險因素和遺傳學基礎,結果證明了增齡、高血壓、抗凝血酶III下降是影響老年冠心病的主要危險因素。同時證明了血小板、抗凝血系統、腎素-血管緊張素系統三種機制參與了老年冠心病的發生與發展,為老年CHD的臨床干預提供了一定的流行病學及遺傳學依據。

[1]SamaniN J,ErdmannJ,HallA S,et al.Genomewide association analysis of coronary artery disease[J].N Engl J Med,2007,357(5):443-453.

[2]Meadows T A,Bhatt D L,Cannon CP,et al.Ethnic Differences in Cardiovascular Risks and mortality in atherothrom-botic disease:insights from the reduction of atherothrombosis for continued health(REACH)registry[J].Mayo Clin Proc,2011,86(10):960-967.

[3]The Evaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention(EGAPP)Working Group.Recommendations from the EGAPP Working Group:genomic profiling to assess cardiovascular risk to improve cardiovascular health[J].Genet Med,2010,12(12):839-843.

[4]Winkelmann B R,Hager J,Kraus W E,et al.Genetics of coronary heart disease:current knowledge and research principles[J].Am Heart J,2000,140(4):S11-26.

[5]DouglasH,MichaelidesK,Gorog D A,et al.Plateletmembrane glycoprotein Ibalpha gene-5T/C Kozak sequence polymorphism as an independent risk factor for the occurrence of coronary thrombosis[J].Heart,2002,87(1):70-74.

[6] Antón A I,Teruel R,Corral J,et al.Functional consequences of the prothrombotic SERPINC1 rs2227589 polymorphism on antithrombin levels[J].Haematologica,2009,94(4):589-592.

[7]Tiret L,Rigat B,Visvikis S,et al.Evidence,from combined segregation and linkage analysis,that a variant of the angiotensin I-converting enzyme(ACE)gene controls plasma ACE levels[J].Am J Hum Genet,1992,51(1):197-205.