電針對抑郁模型大鼠五羥色胺及腦源性神經營養因子的影響

史榕荇 ，吳 茜 ，于戰歌 ，李 輝 ，田旭升 ，唐學章 ?

（1.中日友好醫院 針灸科，北京 100029；2.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040）

抑郁癥是精神疾患的常見病種，因為發病率高，知曉率低，危害嚴重，給家庭和社會造成沉重負擔。近年來，抑郁癥的預防和治療得到學術界的廣泛關注，但由于發病機制至今沒有得到肯定、明確的揭示，其發病率不降反升[1]。

近現代以來，臨床醫生將電針療法廣泛應用于抑郁癥的治療，取得肯定的療效，認為電針對抑郁癥起整體調節作用，可以干預機體恢復固有的動態平衡。1984年，羅和春[2]開始對電針治療抑郁癥進行規范化研究，為電針的作用機制提供了頗具說服力的科學佐證。

迄今為止，比較明確的是腦內5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神經系統失衡改變與抑郁癥發病有直接的關系[3]，腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF） 對腦神經細胞具營養作用，而5-HT能神經元與BDNF因子之間存在交互作用。有實驗得出電針可抑制HPA軸亢進，同時提高損傷大腦海馬內BDNF蛋白表達[4]。本研究觀察了電針對抑郁模型大鼠海馬內5-HT、BDNF含量表達的影響，以探討電針調整抑郁癥大腦功能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物和分組

雄性 SD 大鼠，120 只，體重 160～180g，維通利華實驗動物技術有限公司提供。通過開野實驗將水平運動次數加垂直運動次數不足30次或超過120次的大鼠剔除，選取符合條件大鼠40只隨機分組。實驗期間除特殊要求外，其余時間均飼養于溫度（18℃～25℃）和濕度（55%±2%）相對恒定的動物飼養室，自然光線，自由進食水；隨機分為4組：空白對照組、抑郁模型組、陽性西藥對照組（氟西汀）、電針治療組，每組10只。

1.2 造模和干預方式

造模動物全部孤養，實驗期間每天隨機給予一種應激刺激，包括斷食（24h）、斷水（24h）、晝夜顛倒（24h）、夾尾（180s）、溫箱（40℃，5min）、冷水游泳（14℃，5min）、電擊足底（電壓 30V，電擊 5s，間歇5s，共進行120s）平均每種刺激3次，共21d。參照 “實驗動物針灸穴位圖譜”（全國針灸學會實驗針灸研究會制定）選取大鼠百會、印堂穴，平刺進針，百會穴針尖方向向后頭部，印堂穴針尖方向向鼻尖，刺入深度約為0.5～1cm，使用HANS，LH202型電針治療儀0.6mA/2Hz，每次造模前1h對電針組行電針干預，1次/d，每次20min，共21d。造模期間，每天應激刺激前1h西藥對照組灌胃給藥氟西汀（fluoxetine，氟西汀），美國禮來公司生產，批號 104041，按 0.18mg/kg體重，0.018mg/ml濃度灌胃給藥，1次/d，共21d。

1.3 檢測指標

1.3.1 酶聯免疫吸附法樣品制備及檢測

最后一次實驗結束后，大鼠斷頭于冰皿上快速剝離海馬，用生理鹽水沖洗干凈，立即放入清潔的5ml塑料離心管中，置于－85℃冰箱中備用，檢測5-HT的含量。

檢測方法按試劑盒說明書進行操作。實驗用試劑盒由北京尚柏生物醫學技術有限公司提供，美國Biosource公司生產。

1.3.2 Western-blot法樣品制備及檢測

實驗用抗體：羊抗兔抗BDNF為美國Santa Cruz Biotechnology公司產品；DYY-Ⅲ-8B穩壓穩流型電泳儀，北京市六一儀器廠；X光膠片自動沖洗機為美國Proce公司產品；FluochemV2.0型凝膠圖像分析系統為美國阿爾法公司產品。

使用超聲勻漿器在冰上迅速研碎海馬組織；加入400μl含PMSF的變性裂解緩沖液，在冰上放置30min；裂解30min后，用移液器將裂解液移至2ml離心管中，4℃，12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置-20℃保存。使用紫光分光光度法測樣品中蛋白濃度。取10μl樣品，稀釋40倍至400μl，置分光光度計中檢測OD260和OD280。計算蛋白濃度。根據測定的蛋白含量，取含50μg蛋白的樣品溶液，加入1/4體積5×buffer，混合后于沸水中煮10min使蛋白變性，等待上樣；加入樣品，接通電源開始電泳，條帶在積層膠范圍時使用80V電壓，到達分離膠時改用120V電壓。半干式電轉移法將膠中蛋白質轉移至膜上，封閉實施免疫反應，加入一抗，4℃過夜。用封閉液將抗兔二抗以1：2000比例稀釋，將β-Actin所處部位的膜置于抗體溶液中，排盡氣泡，分別密閉袋口，室溫緩緩搖動1h。暗室中，將膜蛋白面朝上放入X光片夾中，曝光2min后洗出膠片。用凝膠圖像分析系統掃描膠片，并分析目標條帶的分子量和凈光密度值。目的蛋白的灰度值除以內參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

1.4數據處理

對原始數據進行單因素方差分析。

2 實驗結果

2.1 電針對抑郁模型大鼠海馬內5-HT的影響

由表1可見，給予慢性應激刺激后，模型組大鼠海馬5-HT含量較正常組顯著減少 （P＜0.01），電針組大鼠海馬5-HT含量較模型組顯著增加（P＜0.01）。

表1 電針對抑郁模型大鼠海馬5-HT含量的影響（x-±s）

表2 各組BDNF蛋白含量的比較（x-±s）

圖1 BDNF在海馬組織表達的蛋白印記圖

2.2 電針對抑郁模型大鼠海馬內BDNF蛋白含量表達的影響

由表 2及圖1的Western blot印跡結果可見，實驗結束后各組大鼠海馬中BDNF蛋白均有表達，與正常組相比，模型組BDNF蛋白表達量顯著降低（P＜0.01）；電針組蛋白表達量較模型組顯著增加（P＜0.01）。

3 討論

電針和電休克療法（ECT）均對頭部進行電流刺激，二者作用機制可能有相似之處。有研究表明，ECT可改變大鼠腦內不同區域多個基因表達，這些基因參與多條神經傳導通路，而其中CREB（cAMP response element binding）-BDNF 通路為近年來研究的熱點。有研究[5]表明，改變CREBBDNF通路相關基因的表達，阻斷、逆轉神經元細胞的萎縮和凋亡，對恢復腦的功能可產生積極意義。電刺激通過改變抑郁癥神經可塑性基因的表達而改善抑郁癥癥狀，為電針干預抑郁癥神經營養假說的研究提供了新思路[6]。

有藥理學實驗結果表明，5-HT再攝取抑制劑等藥物治療的起效出現延遲，時間約為4～6周，這表示該種機制僅為抑郁癥發病機制的一部分，而神經可塑性機制的存在，一定程度上解釋了這種效應延遲現象[7]。我們的研究證實：模型大鼠出現海馬內5-HT含量降低，同時觀察到腦神經營養因子表達降低，說明抑郁狀態下BDNF表達降低，神經元營養障礙，這是導致神經細胞形態、功能受損可能的原因。電針能夠有效抑制模型大鼠海馬內5-HT水平變化，同時增加海馬內BDNF蛋白表達含量，維持神經可塑性、保護神經功能產生良性調節，這是電針對抑郁模型大鼠產生良性干預作用可能的機制。本實驗還觀察到，電針可同時對5-HT系統和腦神經營養因子產生良性干預，再次印證了電針對機體產生多環節、多靶點的平衡調節作用，這是電針起效迅速，而無毒副作用等不良反應的可能原因。

本研究為電針對腦源性神經營養因子影響觀測的初步結果，至于電針在整條神經營養通路中如何起效，電針調節CREB-BDNF通路上多環節、多靶點的機制，以及電針調整5-HT系統與腦源性神經經營養因子系統之間交互作用的內在聯系等問題，尚待進一步探討和研究。

[1]黃泉智，許成勇，王發渭.中醫治療抑郁癥的現狀與展望[J].中華保健醫學雜志，2011，13（2）：77-78.

[2]羅和春，錢瑞琴.中西醫結合治療抑郁癥新進展[J].中國中西醫結合雜志，2009，29（3）：197-198.

[3]王樹桂，潘瑩.抑郁癥藥物治療進展[J].中國民族民間醫藥，2011，（1）：35-36.

[4]李文迅，韓焱晶，陶娟，等.電針對抑郁模型大鼠海馬神經元凋亡影響的研究[J].中國中醫藥信息雜志，2005，12（2）：33-35.

[5]Altar CA，Laeng P，Jurata LW，et al.Electroconvulsive seizutes regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways[J].J Neurosci，2004，24：2667-2677.

[6]Molteni R，Calabrese F，Bedogni F，et al.Chronic treatment with fluoxetine up-regulates celluar BDNF mRNA expression in rat dopaminergic regions[J].Int J Neuropsychopharmacol，2006，9：307-317.

[7]徐林.抑郁癥的神經可塑性機制[J].中南大學學報，2008，34：326-330.