黃瓜性別決定的分子機理研究進展

趙志剛，柳美玲

（1 空軍司令部 南苑農副業基地，北京 100076; 2 中國農業大學 農學與生物技術學院，北京 100193)

黃瓜(Cucumis sativus L)是世界十大蔬菜之一，是我國第一大保護地蔬菜作物，是農村致富和農民增收的重要產業。根據聯合國糧食及農業組織統計數據，2009年我國黃瓜栽培面積已達175.3萬公頃，總產量為2324.7萬噸，分別占我國蔬菜總播種面積和總產量的19.3%和15.6%，占同期全球黃瓜總量的64.9%和59.1%（FAOSTAT, 2009），栽培面積和總產量均占世界首位。但是，相對于世界發達國家如荷蘭、法國，我國黃瓜的單位面積產量低（我國黃瓜單位面積產量為13.3hg/hm，低于世界平均水平14.6萬hg/hm），產品品質整體水平差，嚴重影響了黃瓜的出口量和農民的收入。

新品種的培育是實現農作物高產優質的主要原動力，而全雌系或強雌系品種是黃瓜優勢育種的重要途經。黃瓜，由于其豐富多樣的性型表現而成為研究高等植物性別決定的模式植物[1]，黃瓜的性型包括雌雄異花同株(Monoecious)、純雌株(Gynoecious)、兩性株(Hermaphroditic)、雄花兩性花同株(Andromonoecious)以及三性株(Trimonoecious)[2]。其中，雌雄異花同株是最普遍的性別表達類型。在雌雄異花同株中，沿著主莖的花的發育可以分為三個階段:第一個階段是雄花形成階段，第二個階段是雌花和雄花均形成的混合階段，第三個階段是雌花形成階段。

本文綜述了黃瓜性別決定的最新分子機理研究進展，旨在為培育高產優質的黃瓜雌性系品種提供理論基礎。

1 黃瓜的花

黃瓜的花包括單性花和兩性花，但是在發育早期，所有的花原基都包含四個輪生體，分別是萼片、花瓣、雄蕊和心皮，而單性花（雌花或雄花）的形成來自于黃瓜花發育過程中雄蕊或心皮的選擇性敗育[3]。有研究發現雄蕊的敗育主要發生在花藥原基，這種敗育與DNA的損傷密切相關[4]。通過對黃瓜花的同源突變體的研究表明，雄蕊或心皮發育的抑制依賴于輪生體的位置，而不是花器官的性別屬性[3]。在雄花中，心皮原基的敗育是先于花芽發育過程的第六階段子房的分化，而在雌花中，花藥和花絲的敗育發生在花芽發育第七階段花藥DNA降解之后[4]。

2 影響黃瓜性別的因素

黃瓜的性別決定是一個復雜的過程，受多種的因素影響，包括基因型、植物激素以及外界環境條件。

2.1 影響黃瓜性別的基因

黃瓜的性別主要受三個基因調控：F、M和A。F基因是半顯性的，其作用是加強雌性，促進雌性較早發育，并使雌花向低節位發育[5]。M基因抑制雄花的發育，但不影響花在植株上的分布和排列。A基因抑制雌花發育，增強雄性，對F基因有上位效應[6]。F、M和A三個影響黃瓜性別決定的主效基因相互作用產生各種不同的性別表型：全雌花基因型為F-M-AA/Aa/aa，雌雄異花同株為ffM-A-，雄花兩性花為mmffA-，兩性花為F-mmAA/Aa/aa，純雄株為ff MM/Mm/mm aa。

氨基環丙羧酸(ACC)合酶在黃瓜花芽分化過程中起到信號轉導作用[7]，乙烯被認為是黃瓜的“性激素”，它既促進雌性的表達，也同時抑制雄性的表達。乙烯的合成途徑為甲硫氨酸-S腺苷甲硫氨酸(SAM或AdoMet)-ACC-乙烯[8]。其中，ACC合酶催化SAM形成ACC，是乙烯合成的主要限速酶，所以ACC合酶基因家族對黃瓜性型分化具有重要作用。

研究表明，F基因即Cs-ACS1G，它被認為是由ACC合酶基因CsACS1新產生拷貝的上游序列與另外一個基因BCAT的部分區域重組而成[9]，從而改變基因的啟動子區域。目前，Cs-ACS1和Cs-ACS1G的啟動子區域已經被克隆[10]，這兩個序列都包含典型的啟動子順式作用元件比如TATA盒子和CAAT盒子，另外，還包含一個生長素誘導的TGTCT元件。Cs-ACS1G是由Trebitsh等首先在黃瓜雌性系中發現的，而在鄰近的等基因的雌雄同株系中卻沒有[11,12]。2005年，陳惠明[6]等以不同性型的黃瓜為研究材料，通過針對CsACS1G基因設計的特異SCAR引物分析了CsACS1G基因與F基因以及雌性性狀之間的關系，并對CsACS1G進行了定位結果也表明了Cs-ACS1G與Cs-ACS1基因的差異主要在啟動子區。利用北京蔬菜研究中心構建的黃瓜連鎖圖譜，成功將Cs-ACS1G基因特異的SCAR標記定位在第10連鎖群上。隨后，程立寶等人克隆了Cs-ACS1G基因并對其進行了時空表達研究，表明Cs-ACS1G基因在黃瓜不同組織表達狀況不同，在根尖和莖尖生長點表達強，而在果實和腋芽中表達則很弱。因此，黃瓜Cs-ACS1G基因的時空表達模式存在差異[13]。

2009年，Li等利用圖位克隆的方法分離了黃瓜的M基因[14]。M基因編碼乙烯合成途徑中的一個關鍵酶CsACS2，該酶關鍵氨基酸的突變可導致兩性花變成單性花[14]，與甜瓜中抑制雄花發育的a基因類似[15]。有研究表明乙烯通過影響M基因的產物從而抑制黃瓜中雄蕊的發育[7]。CsACS2基因的表達主要集中在發育的雌蕊原基基部，且持續時間較長。另外，Cs-ACS2基因在雌雄同株和純雌株的莖尖以及黃瓜子房中表達。

陳惠明等鑒定了兩個新的黃瓜性別表達基因，分別命名為Mod-F1（不完全顯性）和mod-F2（隱性基因），二者均與F和M基因獨立遺傳，能夠增強黃瓜植株的雌性性狀的表達[16]。

目前，在黃瓜中，另外兩個ACC合酶基因CS-ACS3和CS-ACS4也已經被克隆[17]。研究表明CS-ACS3基因受IAA誘導[6]，與Trebitsh[18]等報道的CS-ACS1和CS-ACS1G高度同源，可能是CS-ACS1G基因。但是，Kamachi等人發現，CS-ACS3基因表達量并不隨著黃瓜性別類型的改變而改變，認為CS-ACS3基因與黃瓜的性別關系不大[2]。CS-ACS4基因的表達情況在兩性系和雄全同株系中沒有明顯的不同，但是在短日照（8h）比在長日照(16h)下表達量高。

ACC氧化酶是乙烯合成中的最后一個關鍵酶，ACC氧化酶基因CS-ACO1、CS-ACO2和CS-ACO3也被克隆，Kahana等通過RFLP分析純雌株與雌雄同株雜交的F2分離群體的結果表明F位點(locus)與Cs-ACO2之間的連鎖距離為8.7cM，同時發現CS-ACO2和CS-ACO3的表達與黃瓜的雌性表達呈負相關[19]。有研究表明，被AP3啟動子驅動的黃瓜基因Cs-ACO2在擬南芥中的過表達可以通過誘導染色質的濃縮使擬南芥的雄蕊敗育，與黃瓜雌花發育過程中雄蕊的敗育是一致的[4,20]。乙烯受體基因也是乙烯信號傳遞途徑中的關鍵基因，黃瓜乙烯受體基因CS-ETR1、CS-ETR2、CS-ERS、CS-CTR、CS-EIN3、CS-EIL1、CS-EIL2、CS-ERF1、CS-EREBP等已被相繼克隆。研究表明，M/m基因或者其產物能夠通過控制CS-ETR2、CS-ERS等乙烯受體的表達而控制乙烯信號傳遞，進而實現對黃瓜性別的調控。如雌雄同株和純雌株莖尖中CS-ETR2和CS-ERS基因表達明顯受乙烯的誘導，而在雄全同株中受乙烯誘導的效果不明顯。同時，純雌株中CS-ETR2和CS-ERS的高表達量可能與純雌株內源乙烯含量高有關，并在黃瓜雌性發育中起作用。

另外，黃瓜的性別發育還受MADS-box[21]基因家族調控，MADS-box基因是一類廣泛存在于植物中序列特異的同源異型基因。它所編碼的MADS-box蛋白質是一種轉錄因子，在生物體中通過調節其他基因的表達來發揮其調控作用。上個世紀九十年代Coen和Meye．rowitz提出的ABC模型認為：A、B、C這三類調控花器官特征的基因（其中絕大多數都是MADS-box基因）以聯合或單獨的方式來控制花器官的特征；A基因單獨控制萼片，A基因和B基因共同調控花瓣，B基因和C基因共同調控雄蕊，C基因單獨調控心皮，其中A基因和C基因的作用相互抑制。MADS-box基因家族包括黃瓜的AGAMOUS基因(CAG1,CAG2和CAG3)，CUCUMBER MADS1(CUM1)和CUM26，它們的基因表達隨著花的發育而出現階段性及組織表達特異性變化, 但不受外源赤霉素和乙烯的影響。ERAF17也是一個MADS-box基因[22]，但它在雌雄同株和全雌株中的轉錄時期和水平與乙烯利誘導雌花發育是一致的，因此，ERA F17可能介導乙烯誘導的雌花發育過程。

最近，Gu等人發現的CsCaN基因，具有乙烯誘導性和鈣依賴性，它在雌花發育的過程中參與了花藥原基特異性的DNA損傷，也與黃瓜的性別決定有關[23]。

2010年，Wu等人利用黃瓜的近等基因系材料全雌突變體Csg-G和兩性系Csg-M分離出了性別決定的有關基因，結果在突變體中發現了600個下調基因和143個上調基因[24]。并且，其中一些基因的表達與全雌突變體的組織部位以及花的發育階段有關。他們的研究表明了兩個方面的內容：第一，差異表達的基因參與了植物激素信號傳遞途經，比如ACS、Asr1、CsIAA2、CS-AUX1和TLP，暗示著植物激素以及它們的相互作用在黃瓜性別決定中起著關鍵作用；第二，一些轉錄因子的調節，比如EREBP-9，可能也參與了黃瓜性別決定的過程。

2.2 植物激素與黃瓜性別的關系

除了性別決定的基因，植物激素也參與了黃瓜性別決定的過程。赤霉素和乙烯以及他們的抑制劑的施用能夠改變植物的基因型，赤霉素的作用主要是促進雄性，而乙烯的作用主要是促進雌性。通過對兩性系和雄全同株系的黃瓜處理不同組合的赤霉素和乙烯利，Yin和Quinn指出乙烯是主要的黃瓜性別決定的因素，而赤霉素可能是作為內源乙烯產生的一個抑制因子[25]。這些發現讓他們提出了一個性別決定產生的模型：乙烯既能促進雌性又能抑制雄性。這個模型的基本內容是，F基因應該能夠編碼一種物質，這種物質可以決定內源乙烯在植株上的分布以及生成量，從而作用于植物體促進雌性，而M基因也應該能編碼一種對乙烯敏感的雄性受體因子，這種物質能夠感知到乙烯信號而抑制雄蕊的發育。

乙烯被稱為是植物的“性激素”，其它激素生長素和油菜素內酯，被認為是通過直接或間接影響乙烯的合成或信號傳遞，來實現對植物性別分化的調控[26,27]。

2.3 環境條件與黃瓜的性別決定

環境因素也影響黃瓜的性別分化，如短日照、低溫可以促進雌花產生，而長日照、高溫可以促進雄花的產生[28]。

3 存在的問題及展望

在農民生產栽培中，黃瓜經常出現低雌花率甚至無雌花不能坐果，嚴重影響黃瓜產量，因此培育穩定的強雌或全雌性品種至關重要。然而至今除少數已克隆的性別分化基因外，精確的黃瓜性別決定機制并不清楚，這制約了通過基因工程手段培育優質高產的黃瓜。

從研究方法上看，黃瓜的性別決定研究主要通過同源比對克隆相關基因[13]，如乙烯合成和信號傳遞途徑基因，然后看其表達時間與部位；或通過分子標記法[29-32]，尋找雌性系特異的基因表達，如11-1000。在基因表達水平上，Guo[33]等人利用454測序技術比較了雌性系WI1983G 和兩性系WI1983H花芽的轉錄組表達情況，并發現了214個基因有明顯的表達差異。但是，目前黃瓜的性別決定研究從取材和技術手段上都存在很大的局限性。例如，大多性別決定研究以整個植株或花器官為材料，它是大量的生長、發育等下游基因累積作用后的最終結果，一定程度上忽視了對性別決定調控起關鍵作用的上游基因研究。并且，實驗所用的差顯法和454測序技術，數據量和靈敏度都比較有限。

鑒于此，今后的研究方向可以利用新興的精確度和靈敏度都較高的技術比如激光捕獲顯微切割技術(Laser Microdissection)取樣[34,35]，實驗材料采用黃瓜不同發育時期的幼嫩的花分生組織或者頂端分生組織[36,37]，尋找并克隆性別決定的上游基因，從分子發育學的角度，研究性別決定的分子機理，為培育高產優質的黃瓜雌性系品種提供理論基礎。

另外，雖然黃瓜基因組[38]已經公布，但是有關黃瓜轉錄組方面的信息仍然缺乏，今后可以從特定組織部位的轉錄組水平研究黃瓜的性別決定機制。

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