膠原/羥基磷灰石一體化支架修復關節軟骨缺損的機制研究

劉興漠，項禹誠，潘滔，孫青，王德春，王迎軍，吳剛

目前已有大量實驗研究利用組織工程學技術修復關節軟骨缺損，各種新型修復材料層出不窮，但在臨床上仍不能利用此技術高質量地修復關節軟骨缺損并達到很好的遠期療效[1-2]。這在很大程度上是因為具體的修復機制以及相應的理論尚不明確。在前期研究工作中，我們已證實膠原/羥基磷灰石骨一體化修復體具有良好的生物相容性，并且在動物體內誘導全層關節軟骨缺損的修復[3]。本研究觀察其在實驗性兔膝骨關節全層軟骨缺損修復中對基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)活化和表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及器材 6～8周齡新西蘭白兔45只，體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，購于廣東省醫學實驗動物中心。實驗過程中動物處置符合動物倫理學標準。新型膠原/羥基磷灰石骨一體化修復體由華南理工大學材料科學與工程學院提供，為“雙極”結構，體外實驗證實材料完全降解時間為16周，環氧乙烷消毒備用。免疫組織化學試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒：上海飛捷生物技術有限公司。

1.2 動物造模 實驗動物隨機分為3組，各15只。正常組不予處理，實驗組與對照組分別用10%戊巴比妥鈉10 mg/kg耳緣靜脈麻醉，隨機逐層切開一側膝部皮膚至關節囊，將髕骨推向外側，暴露關節腔，于股骨內外髁間制備全層軟骨缺損，直徑3.5 mm，深6 mm達髓腔，鉆頭配保護圈，防止鉆孔過深；實驗組植入大小、形狀與缺損相似的新型膠原/羥基磷灰石骨一體化修復體，對照組不予修復體植入。髕骨回位，仔細止血，逐層閉合關節囊和皮膚。術后所有動物均肌注青霉素5×105U。膝關節不固定，置籠內自由活動。

1.3 RT-PCR檢測 術后24 h、48 h、1周、2周和4周隨機選取各組實驗動物3只，按照1.2方法麻醉后切開術側膝關節(正常組隨機一側)，切除部分滑膜組織后逐層縫合切口并將動物放回籠內飼養。將取下的滑膜組織行ELISA測定MMPs mRNA的表達水平。按照試劑盒操作說明提取滑膜組織總RNA，紫外分光光度法(260/280 nm)測定MMPs RNA含量及純度，-80℃儲存備用。按照常規方法進RT-PCR實驗。退火溫度58℃，共32個循環。RT-PCR引物設計見表1。擴增完畢后8μl產物2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳，紫外攝像。以目的基因與內參基因條帶的積分吸光度比值表示4個基因的表達水平。同一實驗重復3次。

表1 RT-PCR引物設計

1.4 大體觀察 術后1、2、4周分別靜脈注射利多卡因處死每組動物各5只，取膝關節軟骨，肉眼觀察，采用Wakitani等改良的半定量組織學評分法[4]進行評分。

1.4.1 細胞形態 無透明軟骨細胞：0分；透明軟骨細胞為主：1分；纖維軟骨細胞為主：2分；非軟骨細胞為主：3分；全部非軟骨細胞：4分。

1.4.2 基質染色 正染色：0分；輕度減弱：1分；明顯減弱：2分；未著色：3分。

1.4.3 表面平整度 表面光滑：0分；表面較光滑：1分；表面不規則：2分；表面極不規則：3分。

1.4.4 新生軟骨厚度 ≥正常2/3：0分；達正常軟骨1/3～2/3：1分；＜正常軟骨1/3：2分。

1.4.5 與周圍正常軟骨組織整合 兩邊結合：0分；一邊結合：1分；不結合：2分。

1.5 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。數據以(±s)表示，分別對各組檢測結果的數據進行單因素方差檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察 術后實驗動物雙膝活動少，至1周時活動增加，行走正常，手術切口愈合良好，均無感染。術后2周實驗組缺損區由新生乳白色組織填充，表面平整，有光澤，與周圍正常軟骨界線模糊(圖1a)，而對照組缺損區無明顯修復(圖1b)；術后4周實驗組缺損區外觀與周圍正常軟骨組織相似，不易辨別，切面可見修復組織與周圍結合緊密(圖1c)，對照組缺損區由白色纖維組織填充，表面粗糙，與周邊正常組織界線明顯，切面可見修復組織不完全填充缺損區(圖1d)。各時間點兩組間Wakitani半定量組織學評分差異有統計學意義。見表2。

表2 術后不同時間點修復組織Wakitani半定量組織學評分

2.2 關節滑膜MMPs mRNA表達 3組關節中術前、術后均有MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達。正常組4種MMPs絕對表達值極低，相對表達值維持恒定；實驗組和對照組4種MMPs的表達水平在術后24 h達到峰值，并在4周內逐步下降。其中術后1周實驗組和正常組MMP-2表達差異無統計學意義(P＞0.05)，術后48 h實驗組和正常組MMP-3表達差異無統計學意義(P＞0.05)，術后1周實驗組和正常組MMP-9表達差異無統計學意義(P＞0.05)，術前和術后4周實驗組MMP-13表達差異有統計學意義(P＜0.05)，術后4周實驗組和對照組MMP-2表達差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 不同時間點各組MMPs表達(n=3)

圖1 術后不同時間點關節軟骨修復結果

3 討論

顏煒群等在國內首次將軟骨細胞體外培養成軟骨組織，推出了軟骨組織工程新技術[5]。目前各種治療軟骨缺損的支架材料各有優缺點，但尚無完全理想的軟骨組織工程支架材料，這是因為天然材料支架存在一定的免疫原性，與細胞復合后存在易發生收縮和碎裂、力學強度較差等不足和缺陷[6]；另外，作為軟骨細胞賴以生存的三維空間，理想的生物支架材料不僅必須具有良好的生物相容性，同時還必須為種子細胞提供合適的黏附、分化、增殖微環境。直接移植成熟軟骨，其退行性變發生較早且嚴重[7]。

本實驗采用的支架材料為“雙極”結構，包括適于軟骨細胞生長的修復體上層以及適合骨細胞生長的修復體下層。上層結構主體由經過改性的生物大分子組成，并復合具有緩釋作用的促進軟骨細胞生長的生長因子釋放微球及其他生物活性成分；下層結構主體以高生物活性的納米鈣磷鹽組成，同時復合相關的生長因子釋放微球、部分天然大分子及其他生物活性成分。我們的前期研究已證實所采用的一體化修復材料無毒、無刺激性，具有良好的生物安全性，并能促進關節軟骨和與之相聯系的軟骨下骨協同修復[3]。楊波等利用掃描電鏡觀察支架材料的超微結構時發現，新型膠原/羥基磷灰石骨支架材料的骨層和軟骨層之間沒有明顯的物理界面，能確保植入體內后支架與軟骨下骨組織快速結合及固定，提供軟骨再生所需要的生理及力學環境[8]。

MMPs已知有26種，根據其蛋白結構和作用底物的特異性可以分為5個亞型，其中MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13的水解底物均為纖維類膠原，并且是MMPs級聯激活途徑中的關鍵MMPs[9]。

正常關節中MMPs與金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)的表達量極低，由于各種理化因素的影響，MMPs與TIMPs之間的動態平衡被打破，導致關節軟骨細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度降解。大量研究證實，MMPs的過度表達可導致軟骨逐漸出現炎癥、潰瘍、缺損等一系列退行性變[10]。這提示我們，抑制MMPs的活化和表達可以延緩關節軟骨退行性變的過程，為關節軟骨缺損的修復提供良好的細胞生長微環境。

本實驗表明，3組關節中術前、術后均有MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達，但是各時間點正常組4種MMPs在關節軟骨及滑膜中的絕對表達值幾乎檢測不到，其相對表達值(與GADPH比值)維持恒定。而在實驗組和對照組的4種MMPs的表達水平在術后24 h即達到峰值，并在4周內逐步下降。其中實驗組MMP-2、MMP-3和MMP-9分別在術后1周、術后48 h和術后1周的表達水平與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，這說明關節軟骨缺損修復過程中，修復材料對各種MMPs亞型的活化和表達水平均有調節作用。

實驗組MMP-13的表達水平在術前和術后4周有顯著性差異(F=1.73,P=0.0059,n=3)，這可能與MMP-13關節軟骨的缺損和修復的病理生理過程中持續表達有關[9]。有研究表明，MMP-13不僅可以直接降解軟骨基質中的纖維類膠原，而且其他MMPs亞型對Ⅱ型膠原的降解也需要通過MMP-13起作用[10]。

綜上所述，新型膠原/羥基磷灰石一體化修復體能在軟骨缺損修復過程中有效的抑制炎癥因子的活化表達，減少ECM的破壞和降解，為軟骨修復提供良好的細胞增殖分化環境。一體化修復體對MMPs以及其他細胞因子的具體調控機制有待進一步研究。

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