康復訓練對腦梗死大鼠認知功能、海馬內突觸素和神經顆粒素表達的影響

李雨峰，吳瑩，程明，徐麗，黃林，李怡，余茜

腦梗死是一種嚴重危害人類健康的常見病、多發病，幸存者中約70%～80%有不同程度的后遺癥，40%不能生活自理。這些存活的患者常遺留癱瘓、失語等嚴重殘疾并有相應的認知障礙，其中以學習記憶障礙最為常見、持久。如何促進腦梗死后學習記憶功能的恢復成為現代康復治療研究的重點。

大量研究提示，運動訓練能通過促進中樞神經系統的神經再生、修復和突觸的可塑性而改善機體的功能。突觸素(synaptophysin,Syn)為突觸前膜標志蛋白，是一種與突觸結構和功能極為相關的糖蛋白，幾乎所有中樞和周圍神經系統的突觸前終末內均發現有突觸素[1]。神經顆粒素(neurogranin,Ng)是一種新發現的腦特異性突觸后蛋白，主要在大腦皮質、海馬、紋狀體和杏仁核中高表達，可能在學習、記憶、神經系統發育(突觸可塑性)等生理過程中發揮重要作用[2-5]。本研究采用線栓法制成大鼠右側大腦中動脈缺血梗死模型，并對康復組大鼠進行訓練，采用免疫組織化學技術觀察突觸前膜標志蛋白突觸素及突觸后蛋白神經顆粒素的表達變化，并進行神經功能及運動功能評定，探討運動訓練對腦梗死大鼠認知功能影響的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠75只，體重(250±50)g，8周齡，由瀘州醫學院實驗動物科提供。

1.2 試劑和儀器 試劑：多聚甲醛；戊巴比妥鈉；Syn免疫組織化學試劑盒；Ng免疫組織化學試劑盒；多聚賴氨酸；DAB顯色試劑盒(棕色)等。儀器：Ax70熒光顯微鏡；DP-70圖像分析系統；Y-型迷宮；85-2型磁力攪拌器等以及自制滾筒網狀訓練儀、平衡訓練棒、轉棒訓練儀、網屏訓練儀。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分組 參照小泉線栓法[6]制成右側大腦中動脈缺血梗死模型。手術后2 h符合以下4項體征即模型成功：①動物蘇醒后表現為提尾時左側前肢內收屈曲；②同側Hornor氏征；③爬行時向左劃圈；④站立時左側傾倒。

將造模成功的48只動物隨機分為腦梗死自由活動組(模型組，n=24)和腦梗死運動訓練組(康復組，n=24)，每組又分為術后15 d、25 d、35 d 3個亞組，每個亞組各8只。各組大鼠都處于相同的環境喂養中。

1.3.2 運動訓練 康復組大鼠在手術后第5天開始進行運動訓練，采用以下裝置：滾筒網狀式訓練儀：訓練大鼠抓握、旋轉及行走能力；平衡訓練：訓練其平衡能力；網屏訓練：訓練大鼠的抓握能力及肌力；轉棒訓練：訓練其動態平衡。40 min/d，6d/周。

1.3.3 神經功能和運動功能評定 兩組分別于術后15d、25d、35d進行神經功能評定和運動能力評分。

神經功能評分采用Bederson等[7]的評定方法：0級：未有神經缺失癥狀；1級：將大鼠尾巴提起，癱瘓側前肢回收屈曲于腹下，正常側前肢向地面伸展；2級：除1級體征外，向癱瘓側推大鼠時阻力較對側明顯降低；3級：除以上體征外，大鼠有向癱瘓側旋轉的行為。

平衡木行走測評：0分：能跳上平衡木，在上面行走不會跌到；1分：能跳上平衡木，在上面跌到的機會少于50%；2分：能跳上平衡木，跌倒的機會大于50%；3分：在健側后肢幫助下能跳上平衡木，但癱瘓側后肢不能幫助向前移動；4分：在平衡木上不能行走，但可坐在上面；5分：將鼠放在平衡木上會掉下來。

網屏實驗：0分：前爪握住網屏大約5s不會掉下來；1分：暫時握住網屏，需滑落一段距離，但沒有掉下來；2分：在5s內掉下來；3分：網屏轉動時，鼠即刻掉下來。

轉棒行走測評：0分：轉動過程中，鼠可在棒上面行走；1分：在轉動過程中，鼠不會掉下來，時間60s以上；2分：轉動開始后鼠從棒上掉下來；3分：轉動開始前，鼠就從棒上掉下來。

1.3.4 學習記憶能力 術后35 d對相應亞組大鼠進行Y-型迷宮[8]測試：實驗前，將大鼠放入迷宮，使其適應5 min，然后開始實驗。大鼠在通電后從所在亮臂跑到另一亮臂記為錯誤，跑到暗臂記為正確。每天訓練30 min，連續刺激10次后大鼠休息2 min，記錄大鼠學會(連續10次訓練中有9次正確即學會)所需的訓練次數，訓練次數越少表明大鼠學習能力越強。

1.3.5 取材及免疫組化 所有大鼠在康復訓練后各時間點評分后分別取材，每個亞組取材8只。在視交叉前2 mm至視交叉后2 mm范圍內(含海馬的腦段)冠狀取材，經脫水—透明—浸蠟—包埋。進行Syn及Ng免疫組織化學染色。用DP-70圖像采集系統采集圖片，Image-pro Plus 5.1軟件進行半定量分析。每張切片隨機取上下左右中5個視野，分別測定Syn陽性產物信號的面積和Ng陽性產物信號的面積占當時視野面積的百分比，測定其陽性產物平均光密度(OD)值，并減去背景光密度值，得到校正光密度值。

2 結果

在造模程中，模型不成功或死亡27只，分組后，模型組2只、康復組3只大鼠死亡，均進行及時隨機補充，保證每組大鼠數量不變。

2.1 神經功能與運動功能 康復組神經功能、平衡木行走、網屏實驗和轉棒行走術后15 d與同期模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)，術后25 d、35 d均低于模型組(P＜0.05)。見表1～表4。

表1 兩組各時間點神經功能測評比較

表2 兩組各時間點平衡木行走測評比較

表3 兩組各時間點網屏實驗測評比較

表4 兩組各時間點轉棒行走測評比較

神經功能評分與轉棒評分(r=0.574,P＜0.01)、平衡木評測(r=0.685,P＜0.01)、網屏評測(r=0.703,P＜0.01)呈明顯正相關。

2.2 學習記憶能力 康復組大鼠術后35 d Y-迷宮分辨學習能力(67.34±8.05)，明顯優于模型組(102.58±11.73)(t=1.982,P＜0.05)。神經功能與學習記憶能力呈明顯正相關(r=0.567,P＜0.01)。

2.3 Syn、Ng表達 康復組Syn校正光密度值在術后35 d優于模型組(P＜0.05)；Ng校正光密度值在術后25 d、35 d均優于模型組(P＜0.05)。見表5、表6。

表5 Syn在梗死側海馬CA3區的表達(校正光密度值)

表6 Ng在梗死側海馬齒狀回的表達(校正光密度值)

3 討論

Syn為突觸前膜標志蛋白，其密度可間接反映突觸的數量、分布和密度[9]。本研究顯示，梗死側Syn陽性反應物主要分布在紋狀體、海馬及下丘腦。在術后25 d，康復組陽性顆粒數量明顯增多，顆粒小而密集，染色均勻，可見明顯Syn陽性纖維束；術后35 d康復組Syn陽性纖維排列整齊，較前稍有增多，并可見Syn陽性纖維網，校正光密度與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。提示康復訓練可能有促進海馬突觸結構的改建和再建。由于突觸素是構成突觸囊泡特異性的膜通道，突觸素的增加意味著突觸囊泡轉運能力的增強，傳遞效能增強，推測康復訓練可能通過改善突觸的數量或(和)效能來改善認知能力。

Ng廣泛分布于大腦皮質、海馬、嗅球等重要腦區的神經突觸后。目前研究表明，Ng在神經的可塑性及腦部的一些病理生理變化等方面起重要作用，尤其是作為Ca2+敏感性的鈣調蛋白(calmodulan,CaM)結合蛋白及蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的突觸后底物，參與在學習記憶功能中起核心作用的腦內幾種蛋白信號轉導途徑、長時程增強(1ong-term potentiation,LTP)和長時程抑制(1ong-term depression,LTD)等突觸可塑性機制，因而它可能涉及學習記憶的形成和鞏固[4,10]。

本研究發現，Ng免疫陽性反應物呈棕色或棕黃色顆粒狀沉積，在海馬齒狀回內呈3條清晰的條帶(內、中、外帶)。術后15 d康復組和模型組Ng陽性顆粒細小，著色淺淡，沿內帶和外帶邊緣呈條索狀不均勻分布；術后25 d康復組陽性顆粒數量增多，著色加深，分布變得密集，從內帶和外帶逐漸向中帶聚集；術后35 d康復組陽性顆粒數量較前明顯增多，著色明顯加深，顆粒也較前增大。校正光密度在術后25 d康復組較模型組高(P＜0.05)，術后35 d康復組較模型組明顯升高(P＜0.01)，提示康復訓練能夠造成與突觸可塑性密切相關分子含量的改變，從而引起腦功能的變化。由于Ng是一種不具有酶活性的神經元內蛋白分子，其對突觸可塑性的調節與改變細胞內游離Ca2+濃度相關。有文獻表明，Ng基因敲除純合子小鼠表現出嚴重的空間學習能力障礙。海馬腦片中Ca2+-CaM依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、PKC和cAMP依賴的蛋白激酶的活性在基因敲除純合子小鼠較正常小鼠顯著降低[11]。

認知障礙是腦梗死患者最為常見和持久的并發癥，促進腦梗死患者學習記憶能力的改善是腦梗死治療的重點和難點，目前在中樞可塑性研究中，促進學習記憶能力改善的康復機制備受關注。本實驗采用Y-型迷宮評定大鼠逃避條件反射和空間辨別能力，大鼠在Y-型迷宮中學會逃避不適刺激所需的訓練次數代表大鼠形成條件反射和整體學習能力，次數越少學習能力越強。康復組和模型組大鼠處死前分別進行Y-迷宮分辨學習結果為術后康復組明顯優于模型組(P＜0.05)，表明康復訓練(網狀滾筒訓練、平衡木訓練、轉棒訓練、網屏訓練)對腦梗死大鼠認知能力的恢復有促進作用。腦梗死大鼠神經功能與各項運動功能均呈顯著正相關，表明認知能力可隨著神經功能和運動能力的恢復而改善。

余茜等發現，運動訓練可明顯改善運動神經功能和認知能力，使健側海馬突觸界面曲率和突觸后致密物(PSD)厚度增大，穿孔性突觸的百分率增多，突觸穿孔后致密物變為節段，出現多個活性區，使得不同受體簇的不同活性區傳遞功能大大加強，進一步加強了突觸傳遞功能，使其習得性LTP形成速度明顯快于模型組[12-15]。并指出運動康復促進腦梗死大鼠認知能力的恢復可能是通過影響腦梗死鼠健側海馬CA3區N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體通道開放導電水平、開放時間和開放概率來實現的。康復訓練后健側海馬突觸體游離Ca2+濃度變化可影響信息處理過程，最終表現在認知能力行為上。另有研究認為，康復訓練促進雙側大腦皮質Fos陽性神經元表達增強[16]，認為是細胞長期效應被激活的標志，c-fos基因表達和Fos蛋白的生物合成對促進學習記憶過程至關重要。Tischmeyer等報道，大鼠在完成Y-型迷宮視覺辨別任務后，其海馬c-fos mRNA升高，在清醒大鼠海馬齒狀回誘導LTP可導致c-fos基因表達增高[17]，表明康復訓練也可通過提高c-fos基因表達來增進認知能力。

總之，運動訓練對中樞神經系統的作用可通過增加Syn和Ng陽性表達改善腦梗死大鼠認知能力。

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