綿羊血漿中多拉菌素的H P L C測定及其藥動學研究

石艷麗，李 巍，韓彩霞，張子群，李曉云，宋銘忻

（1.東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030；2.中國農業大學動物醫學學院，北京 100193；3.黑龍江出入境檢驗檢疫局，哈爾濱 150036）

多拉菌素（Doramectin，DRM）是20世紀90年代美國輝瑞公司研制開發的新一代大環內酯類抗寄生蟲藥物，DRM是一種阿維菌素的衍生物，經過生物突變合成，在阿維菌素的C25上引入一環己烷而成，是一種最新的動物體內外廣譜抗寄生蟲藥[1-3]。DRM為高親脂類物質，在動物體內具有分布廣、組織排除緩慢、生物半衰期長等特點，因而生物利用率高[4-5]。其藥代動力學特性受給藥途徑、藥物劑型、動物種類和個體差異的顯著影響[6]。

本研究成功研制了多拉菌素澆潑劑，并經臨床試驗證明具有高效、廣譜、安全及使用方便等特點。為了進一步研究多拉菌素澆潑劑的作用特點，為臨床用藥提供理論依據，本文采用C18柱進行樣品前處理與純化，HPLC測定樣品中多拉菌素的含量，對多拉菌素澆潑劑在綿羊體內的藥物代謝動力學進行研究。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

多拉菌素原料藥（浙江海正藥業有限公司提供，批號040801），純度：87.3%；多拉菌素標準品（Sigma公司，批號33993），純度：84.6%；N-甲基咪唑，99%；三氟醋酸酐，化學純（批號F20050926，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈及甲醇，色譜純（德國默克公司）；肝素（批號F20071010，上海山溏化工有限公司）。

1.2 動物

健康綿羊6只，體重（30±0.48）kg，雌雄各半，試驗前飼養觀察一周，給藥前12 h起禁食，自由飲水，采樣期間正常飼養。

1.3 儀器及色譜條件

安捷倫高效液相色譜系統；低溫高速離心機（德國Beckman）；旋轉蒸發器，Laborota 4003型（德國Heidolph公司）；真空抽氣泵，2XZ型（中國臨海市精工真空設備廠）；固相萃取柱：ODSC18柱(100 g·L-1)（中國科學院大連化學物理研究所）；色譜柱：Kromasil KR100C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇（100%）；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；激發波長：365 nm；發射波長：475 nm；柱溫：30℃。

1.4 溶液配制

1.4.1 標準溶液的配制

精密稱取DRM的標準品25 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇（色譜級）溶解并稀釋定容，搖勻，得標準儲備液（250 μg·mL-1），置于4℃冰箱保存，使用時根據試驗需要用甲醇（色譜級）配制到所需濃度。

1.4.2 衍生化試劑的配制

A液：N-甲基咪唑∶無水乙腈（1∶1，V/V）

B液：三氟乙酸酐∶無水乙腈（1∶2，V/V）

1.5 給藥與血樣采集

按照治療劑量0.5 mg·kg-1·bw-1多拉菌素澆潑劑涂擦于綿羊的兩耳及背部，并分別于給藥前及給藥后的2、4、6、8、12、24 h及2、3、4、5、6、7、9、11、14、17、20、24、28、35 d于綿羊頸靜脈采集血樣，10 mL·次-1，肝素抗凝并迅速置冰水中保存，3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿并轉入另一離心管中，于-20℃保存備用。

1.6 藥物提取及衍生化

取0.5 mL血漿樣品添加DRM標準工作液，渦旋震動1 min。加入5 mL乙腈，渦旋震動混勻2 min，3 500 r·min-1離心5 min，取上清，重復兩次，合并上清液。置于旋轉蒸發儀中，減壓蒸干，加入0.5 mL乙腈，渦旋震動混勻，加入9.5 mL水，充分混勻，用C18固相萃取柱進行純化。固相萃取程序：C18柱先用5 mL乙腈進行洗脫，再用5 mL蒸餾水進行淋洗，將樣品過C18柱，依次用1 mL甲醇，10 mL乙酸乙酯進行洗脫并收集洗脫液，用氮氣在60℃沙浴中吹干，殘留物用100 μL N-甲基咪唑-乙腈溶液溶解，加入150 μL三氟乙酸酐-乙腈溶液混勻，靜置15～30 min，再加入750 μL無水甲醇終止反應，待上機測定。

1.7 線性范圍與最低檢測濃度

取血漿樣品0.5 mL，加入多拉菌素標準品溶液，使血漿中多拉菌素的濃度（C）分別為0.1、0.5、1、5、10、15、25、50、75、100 ng·mL-1，參照1.6法制樣，進行HPLC檢測，記錄色譜圖，得峰面積（A），每個樣品重復測定5次，以A對C進行線性回歸，得回歸方程，根據血漿和組織標準曲線的相關系數估計樣品中多拉菌素定量的線性范圍。按信噪比≥3來確定DRM在血漿中的最低檢測濃度。

1.8 精密度及回收率的測定

分別配制含多拉菌素高、中、低（40、20、5 ng·mL-1）3種濃度的血漿樣品各3份，參照1.6方法操作，分別于同日內及連續不同日測定，計算其日內變異系數和日間變異系數及該提取方法的回收率。

1.9 數據處理與統計分析

血藥濃度-時間數據運用Marquardt法迭代擬合，通過對模型擬合的評價，根據AIC最小原則選出最佳模型，計算藥代動力學參數，數據處理選用中國藥理學會編制的3P97程序運行，統計值以平均數±標準差表示（X±S）。

2 結果與分析

2.1 色譜分離

在上述色譜條件下，DRM標準品、空白血漿、空白血漿添加藥物色譜圖見圖1～3。由圖譜可見，本試驗所選用的分析條件可以較好地分離DRM，色譜圖基線平穩，雜質少，DRM與雜質分離良好，色譜峰對稱性好，DRMB1a和B1b分離良好，保留時間適中（B1a為9.5 min)，表明DRM的HPLC檢測條件是比較理想的，從圖中可以看出，DRM在測定條件下與血漿成分分離良好。

圖1 多拉菌素標準品的HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatograms of standard preparation of doramectin

圖2 空白血漿色譜Fig.2 HPLC chromatograms of blank plasma sample

圖3 含多拉菌素血漿色譜Fig.3 HPLC chromatograms of plasma containing doramectin

2.2 線性范圍與檢測靈敏度

多拉菌素在1～100 ng·mL-1濃度范圍內線性關系良好。以A（峰面積）對C（血藥濃度）進行線性回歸，得回歸方程為y=0.287x+0.431，R2=0.9985。最低檢測濃度為0.1 ng·mL-1。

2.3 精密度及回收率

結果見表1。

表1 綿羊血漿中多拉菌素的回收率及變異系數Table 1 Recovery rate and Variation coefficient of doramectin in sheep plasma

由表1可知，多拉菌素的回收率介于98.4%～101.5%之間，日間和日內變異系數均小于10%，表明本試驗方法回收率高，準確度高，符合藥代動力學要求。

2.4 多拉菌素澆潑劑在綿羊體內的藥動學

給藥后不同時間點的綿羊血漿經過樣品處理并進行HPLC測定。給藥后35 d綿羊血漿中的DRM濃度均低于檢測線，藥時曲線見圖4。

圖4 綿羊血漿樣品中時間—多拉菌素平均濃度散點圖Fig.4 Graphic of mean doramectin concentrations distributed at distinct time points in sheep plasma

綿羊皮膚澆注多拉菌素澆潑劑后的主要藥代動力學參數。將試驗所得的血藥濃度-時間數據經3P97程序計算可知，綿羊皮膚澆注多拉菌素澆潑劑后在體內的過程符合二室模型，有關藥代動力學參數見表1。

表2 多拉菌素澆潑劑在綿羊體內的藥代動力學參數Table 2 Pharmacokinetics parameter of doramectin pour-on in sheep （n＝6）

3 討論與結論

本試驗單劑量（0.5 mg·kg-1BW）給綿羊背部澆注0.5%多拉菌素澆潑劑后，血漿中藥物濃度的消除半衰期（T1/2Kβ）為4.95 d，根據半衰期判斷，多拉菌素屬于慢性消除藥物，這與張萍等在犬上的動力學研究（按照0.3 mg·kg-1BW皮下注射給藥，消除半衰期為4.78 d）[7]及張繼瑜等在豬上的藥動學研究（按照0.3 mg·kg-1BW靜脈注射，消除半衰期為6.11 d）[10]結果較接近。本試驗中多拉菌素在綿羊體內的分布半衰期（T1/2kα）為1.89 d，較多拉菌素在犬皮下注射給藥時分布半衰期0.58 d及在豬靜脈注射給藥時分布半衰期1.09 d要大，說明0.5%多拉菌素澆潑給藥在綿羊體內的分布相對其對犬皮下注射及豬靜脈注射的分布較慢，這主要與動物的種屬差異和不同的給藥途徑有關。

藥時曲線下面積（AUC）反映進入體循環藥量的多少，它是評價藥物吸收程度的一個重要指標[8-9]。藥時曲線某一時間區段下的AUC反映該時間內的體內藥量，代表了一次給藥后的吸收總量，反映藥物被吸收的程度[11]。本試驗條件下背部澆潑多拉菌素在綿羊體內的AUC為（144.7±23.36）ng·d·mL-1，這與張萍等[7]皮下注射于犬上AUC值（187.43±24.99）ng·d·mL-1結果相接近，表明0.5%多拉菌素澆潑劑在綿羊體內的吸收較好。

藥物經血管外給藥吸收后的血藥濃度最大值稱為藥峰濃度（Cmax），與給藥劑量、給藥途徑、給藥次數、動物種屬等有關。藥物達到峰濃度所需的時間即為藥峰時間（Tmax），取決于吸收速率和消除速率。兩者是反映藥物吸收快慢的重要指標。本試驗中背部皮膚澆潑多拉菌素于綿羊時的Cmax為（19.93±0.37）ng·mL-1，Tmax為（3.18±0.89）d與Lifschitz等皮下注射于牛上的Tmax值（3.86±1.11）d結果[12]相接近，表明多拉菌素澆潑劑在綿羊體內的吸收較快。

本試驗選用AIC法對多拉菌素在綿羊體內的房室模型進行判定，即根據不同的AIC值，可以確定最佳模型。AIC值越小，則該模型擬合度越好，特別是當兩種模型的殘差平方和值很接近時AIC值較小的模型是最適模型。本試驗條件下測出的多拉菌素在綿羊體內過程符合二室開放模型，這與張繼瑜等在豬體內注射多拉菌素的研究結果[10]相同，而張萍等在犬上注射多拉菌素的動力學模型為一室模型[7]，可見動物種屬差異對藥物的動力學特征是有影響的。大環內酯類藥物在動物血漿中的動力學特性可變性較大，這在牛試驗中已得到證明[13]，本試驗中多拉菌素在綿羊體內的血漿濃度也存在著差異，該結果表明多拉菌素在動物個體內吸收和代謝的個體差異性，在相同的試驗條件下，這種現象對伊維菌素在牛、豬、綿羊和山羊中同樣存在，這可能與動物的體況、性別、年齡和生理狀況有關，但與藥物的固有特性關系不大[10]。

綜上，藥物配方組成或給藥途徑不同，可明顯影響藥物的吸收速率，進而影響其生物半衰期和最大血藥濃度。多拉菌素澆潑劑在綿羊體內血藥濃度較高，吸收分布迅速，可為臨床用藥提供依據。

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