在豬組織籠內恩諾沙星對大腸桿菌的藥效研究

楊雨輝，俞觀泉，吳 昊

（1.海南大學農學院，海口 570311；2.海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海口 570228）

使用體內建立藥動學模型方法評價抗菌藥物對病原菌藥效，可使研究結果更接近客觀實際。已有研究者使用動物感染模型分析抗菌藥物對某些人源性病原菌的療效，并以此為依據獲得一些評價抗菌藥物臨床療效的新觀點[1-2]。在獸醫臨床上，Ramadan等使用綠膿桿菌感染雞的疾病模型進行PK-PD的研究，并獲得一些PK-PD參數[3]，但是這些研究大部分都不能準確獲得抗菌藥物在感染部位的濃度和細菌的生長曲線[4]。因此需要更好的體內模型來進行抗菌藥物體內藥效研究。

根據Bengtsson和Creko的研究，使用組織籠模型進行體內PK-PD研究可解決以上問題，在研究中將藥物直接注射到組織籠中，以克服其他給藥途徑下組織籠內藥物濃度變化緩慢的缺點，組織籠也可以直接注射病原菌，進行組織籠內病原菌數量變化的的研究。利用該模型研究抗菌藥物體內PK-PD關系是較理想的一種方法[5-6]。本研究利用在豬體內安裝組織籠的方法，探討恩諾沙星在組織籠內對大腸桿菌的藥效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及菌種

18頭健康的商品雜交豬（杜洛克×海南豬），體重（59.7±6.3）kg。按常規飼養，自由飲水和采食，飼料為不含抗菌藥物的全價日糧。試驗前適應2周。大腸桿菌2081（44103）為購自中國獸醫藥品監察所的標準菌株。

1.1.2 藥品及培養基

鹽酸恩諾沙星為浙江國邦藥業有限公司生產；恩諾沙星標準品由中國獸藥監察所提供；乙腈為美國TEDIA公司產品；四丁基溴化銨均為上海晶純試劑有限公司產品；普通營養瓊脂為廣東環凱微生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 組織籠的準備及安裝

組織籠的準備，選取直徑為2.5和3 cm的不銹鋼半球和鋼管，首先將鋼質半球用2 mm的鉆頭均勻鉆孔，鉆時注意保持鉆孔間距為3 mm左右，同時將直徑為2.5 cm的鋼管截成長度為3.5 cm的小段，直徑為3 cm的鋼管截成長度為4 cm的小段，并將直徑相同的鋼管與鉆孔的半球焊接，腔內預先放置4～5粒直徑為3 mm的玻璃珠，打磨表面使其光滑，兩種籠的容積分別約為25和42 mL左右，見圖1。試驗前將鋼質組織籠洗凈、包扎、滅菌并烘干備用。

圖1 組織籠Fig.1 Tissue cages

組織籠的安裝，選擇試驗用健康豬，以普魯卡因（5 g·L-1）在豬的耳后頸部兩側進行局部浸潤麻醉后，分別于兩側皮膚以無菌手術分別切開皮膚至岡上肌，形成4～5 cm的小口，鈍性分離，使岡上肌和頸斜方肌之間形成小腔，分別植入一大一小兩個組織籠并縫合切口。術后連續3 d每公斤體重注射青霉素鈉4萬單位，鏈霉素每公斤體重15 mg，每天兩次，防止傷口感染。1周后拆線。2周時以無菌注射器抽空組織籠內組織碎片。5周后手術部位基本恢復正常。

1.2.2 試驗設計與采樣

MIC的測定，采用雙倍試管稀釋法測定恩諾沙星對大腸桿菌的MIC。為了與組織籠內細菌的數量一致，本試驗測定MIC時加入的細菌量大約是5×107cfu·mL-1。

體內PK-PD同步試驗的設計，18頭實驗豬，分為三組，每組6頭，每頭具有4個組織籠，頸部兩側分別具有一大一小兩個組織籠。試驗前24 h將對數生長期的大腸桿菌稀釋10-2后，小籠取1 mL，大籠取1.5 mL（菌液的濃度大約為5×105cfu·mL-1）注射進入組織籠，制作一個感染模型，待細菌在組織籠內孵育24 h后，開始進行試驗，此時即為體內PD-PK模型的0時。于試驗0時按照組織籠終濃度為2MIC，5MIC和8MIC，既組織籠藥物內藥物終濃度為0.8、2.0、3.2 μg·mL-1的劑量向組織籠注入50 mg·mL-1的恩諾沙星溶液，頸部的一側作為對照籠，不注射藥液。分別于試驗后0、0.25、0.5、1、3、6、9、12、24、48 h采取組織籠液1 mL，其中0.5 mL進行細菌數量的測定，0.5 mL進行藥物濃度的測定。

1.2.3 體內抗菌活性的測定

通過平板菌落計數確定組織籠液中活菌數的變化。

1.2.4 藥物濃度的測定

采用高效液相色譜對藥物濃度進行測定[16]。

1.2.5 數據處理

使用Winnolin軟件進行數據的計算，并獲得藥動學參數。

藥效數據中的細菌生長對時間的曲線下面積（AUBKC）計算根據兩個鄰近樣品點所圍成的梯形面積之和進行計算。

2 結果與分析

2.1 豬組織籠制作結果

頸部已成功安裝組織籠的豬如圖2所示。安裝完成后傷口愈合完好，可抽出淡黃色清亮的組織液，說明該豬可用于試驗研究。

圖2 頸部安裝組織籠的豬Fig.2 Swines assembled the tissue cages

2.2 恩諾沙星在豬組織籠內的藥動學特征及藥動-藥效參數

在此試驗條件下，恩諾沙星對大腸桿菌的MIC為0.4 μg·mL-1。恩諾沙星在大、小組織籠內的藥動學特征符合一室模型的藥動學特征，藥動學參數及藥動-藥效參數參數見表1。

表1 恩諾沙星在豬不同大小組織籠內的藥動學參數及藥動-藥效參數(X±S，n=6）Table 1 Pharmacokinetic parameters and PK-PD parameters of enrofloxacin in the tissue cage of swine(X±S，n=6）

結果表明注射相同的藥物濃度后，藥物在小組織籠內的半衰期明顯大于在大組織籠內的半衰期，差異顯著（P＜0.05），在相同大小的組織籠內隨著藥物濃度的增加半衰期表現為增長。

2.3 恩諾沙星對豬組織籠內細菌的殺菌動力學曲線

恩諾沙星在大組織籠內對大腸桿菌的殺菌動力學曲線見圖3，在大組織籠內，無藥對照籠內的細菌在試驗的過程中細菌的數量基本上保持恒定，大組織籠內注入2MIC的恩諾沙星后，細菌在被抑制9 h后，出現再生長現象，大組織籠內注入5MIC或8MIC的恩諾沙星后，細菌的殺菌曲線幾乎重合，并都在24 h后檢測不到組織籠內細菌的存在。細菌在接觸藥物的早期階段下降最為迅速。

恩諾沙星在小組織籠內對大腸桿菌的殺菌動力學曲線見圖4。在小組織籠內，無藥對照籠內的細菌在試驗的過程中細菌的數量也基本上保持恒定，小組織籠內注入2MIC的恩諾沙星后，細菌在被抑制12 h后，出現再生長現象，小組織籠內注入5MIC或8MIC的恩諾沙星后，細菌的殺菌曲線幾乎重合，小籠注入5MIC的藥物濃度后，籠內在24 h后檢測不到細菌的存在，而注入8MIC藥物濃度的小籠，在注藥12 h后，組織籠內就不再能夠檢測到大腸桿菌的存在。小籠內細菌在接觸藥物的早期階段也表現為迅速下降。

圖3 不同濃度恩諾沙星在大組織籠內的殺菌動力學曲線Fig.3 Killing bacteria curve of different concentration enrofloxacin in the big tissue cage

圖4 不同濃度恩諾沙星在小組織籠內的殺菌動力學曲線Fig.4 Killing bacteria curve of different concentration enrofloxacin in the small tissue cage

2.4 組織籠內細菌暴露于不同濃度藥物后3 h內活菌數減少值

組織籠內細菌暴露于不同濃度藥物后3 h內活菌數減少的對數值見表2。

表2 注射恩諾沙星后在組織籠內3h內活菌數減少值（logcfu·mL-1，X±S，n=6）Table 2 Decreasing value of the valid bacteria in 3 hours after injecting enrofloxacin（logcfu·mL-1，X±S，n=6）

在大小組織籠注入不同濃度恩諾沙星，在接觸細菌3小時內殺滅大腸桿菌的程度比較表明，2MIC與其他各濃度在3 h內菌數減少的lg值之間差異顯著（P＜0.05）。從5MIC到8MIC濃度在3 h內菌數減少的lg值之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 組織籠內殺菌動力學曲線下面積(Area under the bacterial kill curve,AUBKC)

不同藥物不同濃度在組織籠內殺菌曲線下面積的結果見表3。對于恩諾沙星，隨著抗菌藥物的濃度增加，表現為殺菌曲線下面積減少。

表3 不同濃度恩諾沙星在組織籠內殺菌曲線下面積(X±S，n=6）Table 3 Area under the bacterial kill curve of different concentration enrofloxacin in tissue cage(X±S，n=6）

3 討論與結論

3.1 試驗設計

對于使用組織籠研究抗菌藥物的療效研究，多采用動物一側給藥而另一側作為對照的方法進行試驗[6]。在本研究中，采用此試驗設計，主要是從給藥的劑量和方式來考慮。兩個組織籠容積共有67 mL，豬體重60 kg，組織籠容積相對于豬的體積可以忽略。以組織籠的大小為依據計算給藥劑量，藥量少，由于采用直接向組織籠內注藥，藥物半衰期相對很長。因此，在試驗期間進入血液藥量較少，而進入另一個組織籠的藥量更少，故可以忽略用藥量對對照組織籠內細菌產生的影響，因此本研究采用的試驗設計可達到研究目的。

3.2 注射藥物進入組織籠的藥動學特征

本研究直接向組織籠內注藥，沒有藥物吸收過程，此種給藥方式與靜注給藥的藥動過程相仿，因此在進行藥物代謝動力學數據的計算時，采用一室靜注給藥模型進行藥物代謝動力學模擬計算。計算結果表明所有模擬的相關系數R都在0.9以上，說明靜注一室模型可較好地模擬組織籠注射藥物后藥動學特征。

使用組織籠研究抗菌藥物的抗菌效果發現，動物給藥后，組織籠內的藥物濃度上升和下降速度非常緩慢[7-12]，為了克服肌肉注射后，組織籠內藥物濃度上升和消除緩慢這一缺點，本研究采用直接向組織籠內注射藥物方式進行給藥，結果表明，此方法可以克服肌肉注射給藥后藥物在組織籠內濃度較低和半衰期較長缺點，使得恩諾沙星在組織籠的半衰期較肌肉注射給藥后藥物在組織籠內的半衰期降低了近一半[13]，且可以通過控制注射藥物劑量控制組織籠內藥物濃度，是目前研究抗菌藥物在動物體內PK-PD同步關系較為理想的方法。

在本研究中藥物在小組織籠內的半衰期明顯大于在大組織籠內的半衰期，差異顯著（P＜0.05），在相同大小的組織籠內隨著藥物濃度的增加半衰期表現為增長。據報道藥物在牛組織籠內的半衰期隨著藥物的不同和組織籠大小也存在著差異，在相同大小的組織籠內，隨著藥物濃度的增加，藥物的半衰期增加，這與本研究的結果相同，但對于籠的大小與半衰期關系的結果卻與本研究相反[5-6]。根據分析這主要是由于本研究中使用的組織籠大小和形狀設計與Greko對組織籠的大小和形狀設計不同導致的。在Greko的研究中，使用的大小組織籠只是長短上有差異，籠端面積，即籠內液體與籠外組織接觸面積是相同的，所以結果表現為藥物在大籠（長組織籠）內半衰期長，而在小籠（短組織籠）內半衰期短。本研究使用的大小組織籠直徑不同，長短差異較小，故藥物在小組織籠內半衰期長，而在大組織籠內半衰期短的特點。

制作感染籠并直接向組織籠中注入藥物，可以確切了解局部感染用藥后的治療效果，如果已經明確某藥物在該局部的藥動學特征，就可以通過改變組織籠的大小和形狀，控制藥物在組織籠內的半衰期，使其與該局部的藥動學特征相符。使用此研究方法，對研究動物用藥后某部位的具體療效具有指導作用。

3.3 藥物對豬組織籠內細菌的殺菌動力學曲線

由組織籠內細菌暴露于不同濃度藥物后3 h內活菌數減少值可見，在動物組織籠內恩諾沙星的藥效與藥物濃度有關，藥效呈隨濃度增加而增加趨勢，此規律在體外模型的研究中已有報道[16]，說明在豬體內恩諾沙星的殺菌規律與體外結果一致。由于體內條件下還涉及到宿主的免疫因素，因此體內試驗更接近客觀事實。

在以前的報道中，認為峰濃度和AUC是氟喹諾酮類藥物發揮抗菌作用的關鍵因素，且氟喹諾酮類藥物的peak/MIC比率對于臨床療效和減少耐藥性是最重要參數[14-16]。本研究中，大組織籠內注入2MIC的恩諾沙星后，細菌在被抑制9 h后，出現再生長現象，大組織籠內注入5MIC或8MIC的恩諾沙星后，細菌的殺菌曲線幾乎重合，這說明5MIC和8MIC的殺菌強度相同，并都在24 h后檢測不到組織籠內細菌。而在小組織籠內注入2MIC的恩諾沙星后，細菌在被抑制 12 h后，出現再生長現象，小籠注入5MIC的藥物濃度后，籠內在24 h后檢測不到細菌，而注入8MIC藥物濃度的小籠，在注藥12 h后，組織籠內就檢測不到大腸桿菌。由以上結果表明，當藥物濃度較低時，細菌可出現再生長現象，半衰期決定了藥物出現再生長的時間，半衰期長的出現再生長的時間較晚。當濃度較高時細菌可被完全殺滅，但完全殺滅的時間也與半衰期有關，相同的藥物濃度，半衰期長的殺滅細菌的速度快。此結果在體外藥動藥效同步模型研究中被發現[17]，Blaser等在使用體外模型研究依諾沙星對幾種細菌的體外藥效時，也觀察到細菌的再生長現象，在所有的peak/MIC比率中，只有peak/MIC＞8，才能避免細菌在模型內的再生長[18]。本試驗中peak/MIC＞5，組織籠內的細菌就不會出現再生長現象。這說明，如果藥物在體內消除慢，可以適當減少抗菌藥物的用量。恩諾沙星對大腸桿菌的藥效與濃度有直接關系，如藥物在感染部位的半衰期長，用藥量可適當減少。

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