民豬CIRP基因的克隆與冷誘導研究

張冬杰，劉 娣，汪 亮，別 墅，楊國偉

（黑龍江省農業科學院，哈爾濱 150086）

冷誘導RNA結合蛋白（Cold inducible RNA-binding protein，CIRP）是在哺乳動物細胞中發現的首種冷應激或冷休克蛋白，伴隨冷應激過程過量表達[1]。日本Nishiyama實驗室首次從小鼠睪丸細胞中分離到冷誘導RNA結合蛋白，發現溫和冷處理（29～22℃）可顯著提高小鼠CIRP mRNA水平，相反熱處理（39和42℃）則降低其表達水平 。日本Saito實驗室研究證實牛蛙腦中CIRP在冬季強烈表達，而在夏季表達量很低。這表明CIRP表達可能在動物冬眠過程中發揮一定作用[3]。日本Aoki實驗室和Nishiyama實驗室分別證實CIRP具有RNA分子伴侶活性[4]。英國Banks實驗室在發育的非洲爪蟾神經組織內發現該基因瞬時表達，這表明在神經發生過程中發揮重要作用[5]。我國從2005年對CIRP進行研究。李安民實驗室報道CIRP在腦缺血時表達及亞低溫下冷誘導CIRPmRNA在大鼠腦內的表達情況[6]；楊煥民實驗室克隆BALB/C鼠睪丸組織中CIRP，并制備與鑒定CIRP多克隆抗體[7]。為進一步探討CIRP基因在豬上的生物學功能，本研究克隆民豬的CIRP基因mRNA序列，對該基因在不同組織的表達水平進行了檢測，并分析冷誘導下該基因的表達變化情況。

1 材料與方法

1.1 材料

75日齡民豬3窩共計12頭，將每窩個體隨機分成2組即常溫組和低溫組，每組各6頭，購自黑龍江省農科院畜牧研究所。2009年12月25日到2010年1月6日期間，將常溫組置于正常舍內飼養，溫度控制在（10±2）℃，低溫組在舍外半敞式大棚內飼養，溫度為（-20±3）℃，兩組均飼喂相同的飼料。處理結束后，屠宰，取腿部肌肉組織各10 g，以液氮保存帶回實驗室，-80℃冰箱凍存。

感受態細胞(購自北京原平皓生物技術有限公司)；rTaq酶、限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ、T 載體、TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver3.0(購自TaKaRa公司)；膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒（購自天根生化科技有限公司）；SYBR Green PCR Master Mix（購自美國ABI公司）；TRIZOL（購自Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 民豬CIRP基因的克隆

以GenBank上已公布的人CIRP基因序列（NM_001280）為源序列，使用BLAST在線軟件進行相似序列搜索，找到一條豬的完整EST序列（AK235139），經反復比對后，初步認定為該EST序列即為豬的CIRP基因序列，據此共設計2對引物進行CDS全長序列的擴增，引物序列如下：CIRP1F： 5'GCCGTTGTGCTGTGCTGTCT 3'， CIRP2R：5'TAGTCCCTGGAGCCGCCATA 3'，預計擴增長度510 bp左右；CIRP3F：5'GCTCCAGGGACTACTA CAGC 3'，CIRP4R：5'CCTTAGCCACTTCAAATA CAACAT 3'，預計擴增長度800 bp。PCR擴增結束后使用膠回收試劑盒回收目的片段，連入T載體后，轉化入大腸桿菌，過夜培養后，搖菌提質粒，送交北京華大生物公司測序。

1.2.2 生物信息學分析

用DNAMAN6.0和DNAStar7.0軟件對所測得序列進行拼接和分析；用ProtParam tool軟件進行氨基酸組成、等電點分析；利用用NCBI的Conserved Domains程序對蛋白的保守結構域進行預測；使用TMpred和TMHMM對蛋白質進行跨膜區分析；利用NetPhos 2.0 Server和NetPhosK 1.0 Server軟件對蛋白質進行磷酸化位點的預測。

1.2.3 冷誘導后CIRP基因的表達變化

將常溫組和低溫組個體肌肉的cDNA分別混合，獲得2個cDNA池，分別記為常溫組和低溫組。設計1對特異性引物用以Real-time PCR檢測，選擇β-actin基因作為看家基因，引物序列如下 ： CIRP5F： 5'TGTTCCTGAGCGTAGCAT 3'，CIRP6R： 5'TCCTTAGCCACTTCAAATA 3'， actinF：5'CGGGACCTGACCGACTACCT 3'，actinR：5'GG GCCGTGATCTCCTTCTG 3'。分別以這2個cDNA池為模板，采用二步法進行Real-time PCR擴增。反應體系如下：上、下游引物各0.8 μL，Mix 10 μL，模板0.8 μL，H2O 7.6 μL，共計20 μL。反應程序如下：95℃10 min，95℃30 sec，60℃1 min，40個循環。反應結束后，獲得每個樣本的Ct值，使用如下換算公式進行目的基因最終的相對定量結果：2-△△ct，其中ΔΔCt=（Ct,目的基因－Ct,管家基因）實驗組－（Ct,目的基因－Ct,管家基因）對照組。

2 結果與分析

2.1 民豬CIRP基因序列分析

克隆測序獲得了民豬CIRP基因的3個轉錄變異體，轉錄變異發生在編碼區內。CIRP變異體1基因cDNA長1 278 bp（GenBank登錄號：HQ 908794），其中包括93 bp的5'UTR區，519 bp完整的CDS編碼區以及666 bp的3'UTR區，編碼172個氨基酸，終止密碼子為TAA。ORF由113個腺嘌呤（A）、191個鳥嘌呤（G）、98個胸腺嘧啶（T）和117個胞嘧啶（C）組成，四種堿基的含量依次為21.77%、36.80%、18.88%和22.55%，G、C（59.36%）含量高于A、T（40.65%）含量。

CIRP變異體2基因cDNA長1 653 bp（GenBank登錄號：HQ908795），與變異體1相比，在其編碼區的第501堿基處，出現了一段375 bp的插入片段，該插入片段的第46～48個堿基為TAG，使翻譯提前終止，共編碼182個氨基酸。ORF由115個腺嘌呤（A）、207個鳥嘌呤（G）、105個胸腺嘧啶（T）和122個胞嘧啶（C）組成，四種堿基的含量依次為20.95%、37.70%、19.13%和22.22%，G、C（59.92%）含量高于A、T（40.08%）含量。

CIRP變異體3長1 765 bp（GenBank登錄號：HQ908796），與變異體2相比，在其編碼區的第428堿基處，出現了一段115 bp的插入片段，該插入片段的第5～7個堿基為TGA，使翻譯提前終止，共編碼144個氨基酸。ORF由91個腺嘌呤（A）、164個鳥嘌呤（G）、86個胸腺嘧啶（T）和94個胞嘧啶（C）組成，四種堿基的含量依次為20.92%、37.70%、19.77%和21.61%，G、C（59.31%）含量高于A、T（40.69%）含量。3種轉錄變異體的核苷酸和氨基酸序列比對結果見圖1和圖2。

用NCBI的Conserved Domains程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測該蛋白的保守區域，結果發現在該基因的氨基端具有1個高度保守的RNA結合域（RNA recognition motif）。該保守區域由73個氨基酸組成（第7到第80位氨基酸），其中包含2個高度保守序列，分別為1個氨基酸六聚體（序列為LFVGGL，位置：第8到第13位氨基酸）和1個氨基酸八聚體（序列為RDFGFVTF，位置：第47到第54位氨基酸），其他一些疏水性氨基酸摻雜在這些保守序列中。使用TMpred（http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）和 TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件分析，CIRP不存在跨膜結構域，初步認為冷誘導RNA結合蛋白應是一種存在于細胞質中的蛋白質。NetPhos 2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測 CIRP 三種轉錄蛋白的磷酸化位點結果如表1所示。使用在線軟件NetPhosK 1.0 Server預測特異蛋白激酶的磷酸化位點，臨界值設為0.6，預測結果顯示，變異體1存在7個特異蛋白激酶的磷酸化位點（3個PKA，1個PKB，3個PKC），變異體2存在7個特異蛋白激酶的磷酸化位點（2個PKA，1個PKB，4個PKC），變異體3存在4個特異蛋白激酶的磷酸化位點（2個PKA，1個PKB，1個PKC）。

表1 NetPhos 2.0 Server軟件預測CIRP蛋白的磷酸化位點Table 1 Prediction phosphorylation sites of CIRP protein by NetPhos 2.0 Server

2.2 冷誘導后CIRP基因表達變化結果

將常溫組民豬的CIRP基因mRNA表達量設定為1，以相對表達水平的差異倍數為縱坐標，測得3個重復的CIRP基因mRNA動態表達水平見圖3。t-test結果顯示民豬的CIRP基因的mRNA水平經冷誘導后出現了顯著的上升（P＜0.05）。

圖3 冷誘導后CIRP基因表達變化結果Fig.3 Expression of CIRP gene after cold-induced

3 討論與結論

溫度降低可以降低組織器官的代謝率，并且對心、腦、肝臟等主要臟器功能有明顯的保護作用，這種保護作用很可能是通過冷休克蛋白（Cold shock proteins,CSPs）在低溫條件下的高表達來實現的，但具體是通過何種途徑產生保護作用的機理目前仍不清楚，高等生物中CIRP和RBM3是研究相對較多的CSPs。CIRP廣泛存在于植物、人類、小鼠、大鼠、非洲爪蟾、牛蛙、鮭魚等生物體內，在神經系統發育、胚胎發育等許多進化過程中發揮重要的作用。但到目前為止，還沒有見到關于豬的CIRP基因的相關報道。因此本研究以人的CIRP基因序列為源序列，BLAST比對后發現了一條已公布的完整的豬的EST序列，但按照此序列進行克隆測序后，竟發現3個轉錄變異體，它們在5'端高度保守，但在3'端出現較大變異，而且由于插入序列的存在，使得變異體2和變異體3均出現轉錄提前終止情況。這與Fageeh等在鼠上的研究結果略有不同[8]，他們在擴增鼠的CIRP基因5'-UTR區時發現3個轉錄本，由于轉錄本長度的不同造成轉錄起始位點的改變，進而產生了3個轉錄變異體，而且3個轉錄變異體在不同溫度下NIH-3T3細胞系的穩定性和活性均存在差異，據此推測CIRP表達受到不同長度的mRNA所調控。

冷應激對活體生物基因表達的影響少見報道，和細胞相比生物體具有更加復雜的冷應激調節機制，冷應激會對動物的生產性能[9]、免疫[10]、神經內分泌系統[11]均產生不同程度影響。已報道的關于溫度變化對CIRP基因的表達影響結果基本一致，即高溫會對該基因的表達產生抑制作用[12]，而低溫則可明顯地誘導該基因的表達。本研究結果與前人的研究結果一致，即對民豬低溫冷處理后，肌肉中CIRPmRNA的表達水平出現顯著上升。“冷應激會上調CIRP基因的表達”這一結論已基本得到證實，但其上調表達的作用機理以及生物學意義仍是目前研究的熱點。有人認為CIRP可能是通過激活細胞外信號調節激酶（Extracellular signalregulated kinase，ERK）信號通路來保護細胞免受低溫傷害[12]。

本研究克隆獲得了民豬CIRP基因的3種變異體，3種轉錄變異體的核苷酸序列同源性為86.45%，氨基酸序列同源性為87%。冷誘導后，CIRP基因在肌肉中的表達水平出現顯著升高（P＜0.05）。

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