Hsa-miR-1在人食管癌細(xì)胞株中的表達(dá)及生物信息學(xué)分析

蔣 森，付海龍，徐廣峰，王秀芳，趙亞萍，杜云翔

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽蚌埠 233000;2中國(guó)人民解放軍第82醫(yī)院)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA［1］，參與機(jī)體多種生理、病理機(jī)制。近年研究結(jié)果表明，人類Hsa-miR-1參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡及心臟、內(nèi)耳發(fā)育等生理過程，并與鼻咽癌、肺癌、胃癌等腫瘤發(fā)生有關(guān)［2～5］。食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤，HsamiR-1與ESCC發(fā)病關(guān)系的研究目前鮮見報(bào)道。2011年11月，我們觀察了Hsa-miR-1在ESCC細(xì)胞株中的表達(dá)情況，并通過多個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)、運(yùn)用多個(gè)生物信息學(xué)軟件對(duì)Hsa-miR-1的生物學(xué)特征以及功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，旨在為后續(xù)的Hsa-miR-1功能研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細(xì)胞系ECA109、TE-1、KYSE-150和正常食管上皮細(xì)胞株Het-1A(均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù));胎牛血清(Gbico公司)，1640培養(yǎng)基(Gbico公司)，miRNeasy總RNA抽提試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó) ABI公司)，TaqMan MicroRNA Assay(美國(guó) ABI公司)，ABI7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及Hsa-miR-1表達(dá)水平檢測(cè) 取上述KYSE-150及Het-1A細(xì)胞分別加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照試劑盒說明書步驟提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定總RNA濃度與純度，使A260/A280值在1.8～2.0。根據(jù)試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用實(shí)時(shí)熒光定量-PCR(RT-qPCR)檢測(cè)Hsa-miR-1水平，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。選擇miRNA-U6為內(nèi)參照，應(yīng)用2-△CT方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)來源 利用 miRBase(http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)查找Hsa-miR-1序列，選擇三種在線軟 件 TargetScan6.1［6］(http://www.targetscan.org/)、PicTar［7］(http://pictar.mdc-berlin.de/) 和miRanda［8］(http://www.microrna.org/) 預(yù)測(cè) HsamiR-1的靶基因，取交集，結(jié)合 DIANA LAB-Tar-Base5.0(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/tarbase/)預(yù)測(cè)的Hsa-miR-1靶基因，進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用GeneOntology對(duì)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)的Hsa-miR-1靶基因進(jìn)行功能富集分類，利用Cytoscape中的插件BINGO［9］實(shí)現(xiàn)基因的GO富集分析。采用 DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù) (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對(duì)Hsa-miR-1預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行生物通路富集分析。使用超幾何分布計(jì)算P值，以P≤0.05為顯著性閾值，分別得到相對(duì)于背景具有統(tǒng)計(jì)意義的高頻率注釋。

2 結(jié)果

2.1 人食管癌細(xì)胞中Hsa-miR-1的表達(dá) 食管癌細(xì)胞株KYSE-150中Hsa-miR-1表達(dá)水平顯著低于正常食管上皮細(xì)胞株Het-1A細(xì)胞(P＜0.05)，見圖1。

圖1 KYSE-150及Het-1A中Hsa-miR-1表達(dá)

2.2 miR-1同源性 成熟體 miR-1的5'端種子序列(Seed sequence)在人(Hsa)、獼猴(mml)、家馬(eca)、文昌魚(bfl)、鴨嘴獸(oan)、安樂蜥(aca)、紅鰭東方鲀(fru)、斑胸草雀(tgu)等近100個(gè)物種上均顯示了很好的同源性(見表1)。

2.3 Hsa-miR-1所在基因組特征 Hsa-miR-1家族由2個(gè)miRNAs即Hsa-miR-1-1和Hsa-miR-1-2組成，有兩個(gè)Hsa-miR-1位點(diǎn)分別編碼Hsa-miR-1-1、Hsa-miR-1-2。Hsa-miR-1-1位于人的第20號(hào)染色體C20orf166基因初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的第2個(gè)內(nèi)含子區(qū)。C20orf166基因包括4個(gè)外顯子、2個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，長(zhǎng)度分別為1 220 bp和426 bp，C20orf166基因開放閱讀框(Openreading frame，ORF)大小為 354 bp。MiR-1-2位于人18號(hào)染色體上蛋白質(zhì)編碼基因MIB 1的第12個(gè)內(nèi)含子區(qū)，MIB1基因組全長(zhǎng)為5 356 bp，屬于鋅指基因家族(Zinc fingers，ZZ-type［ZZZ］)，有21個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度為9 576 bp，開放閱讀框大小為3 021 bp。

表1 部分物種miR-1成熟序列

2.4 Hsa-miR-1 靶基因預(yù)測(cè) DIANA LAB-Tar-Base5.0數(shù)據(jù)庫(kù)提供已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持microRNA的確切靶基因，通過檢索DIANA LAB-TarBase 5.0數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-1確認(rèn)靶標(biāo)有196個(gè)(表略)。應(yīng)用 TargetScan、PicTar及 miRanda預(yù)測(cè) Hsa-miR-1的靶基因，取三者預(yù)測(cè)結(jié)果的交集有106個(gè)基因，結(jié)合已證實(shí)的靶標(biāo)基因，共267個(gè)。

2.5 Hsa-miR-1預(yù)測(cè)靶基因的GO分析及通路分析對(duì)所發(fā)現(xiàn)的267個(gè)Hsa-miR-1靶基因進(jìn)行的GeneOntology注釋層次分類及富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-1靶基因在GO生物學(xué)過程注釋中，有5個(gè)基因個(gè)數(shù)超過預(yù)測(cè)靶基因數(shù)50%的富集群，這些富集群主要與生物代謝和調(diào)控等過程有關(guān)(表略);HsamiR-1靶基因在GO細(xì)胞組成分析注釋中，共有6個(gè)富集群基因個(gè)數(shù)超過預(yù)測(cè)靶基因數(shù)50%，主要參與細(xì)胞和細(xì)胞組分的形成(表略)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)267個(gè)靶基因進(jìn)行的生物通路富集分析結(jié)果顯示，在經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG中，miR-1預(yù)測(cè)的靶基因富集于30個(gè)通路中，其中顯著的通路有癌癥通路(Pathways in cancer)、幽門螺旋桿菌感染的上皮細(xì)胞信號(hào)(Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection)、肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy)、擴(kuò)張型心肌病(Dilated cardiomyopathy)、硫酸軟骨素的合成(Chondroitin sulfate biosynthesis)等7個(gè)通路(表略)。

3 討論

miRNA是近幾年分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最重要的發(fā)現(xiàn)之一，Calin等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA多定位于腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，可能具有致癌基因或抑癌基因作用。最近一些研究證實(shí)，miR-1在多種腫瘤中表達(dá)異常，具有抑癌基因的作用，與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡密切相關(guān)，對(duì)于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義［11～13］。本研究結(jié)果顯示，與正常食管上皮細(xì)胞相比，ESCC細(xì)胞中Hsa-miR-1表達(dá)明顯下調(diào)，提示Hsa-miR-1可能參與ESCC的發(fā)病機(jī)制，具有抑癌基因的作用。

miRBase上的數(shù)據(jù)顯示，至2012年6月，在植物、病毒、動(dòng)物和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的miRNA已有18 000多種，其中人類miRNA有2 000多種。已有研究表明，一條miRNA通常具有調(diào)控多個(gè)基因的功能，而同一基因也可能同時(shí)受多個(gè)miRNA時(shí)空特異的精密調(diào)控，此種調(diào)控方式導(dǎo)致miRNA的功能研究頗具復(fù)雜性，僅依靠實(shí)驗(yàn)手段研究miRNA已變得相當(dāng)困難。生物信息學(xué)在miRNA研究中扮演著越來越重要的角色，其可通過對(duì)海量和復(fù)雜信息進(jìn)行分析和處理而為下一步實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)，其在miRNA研究中的作用主要包括識(shí)別miRNA、對(duì)miRNA基因注釋、預(yù)測(cè)miRNA靶基因及分析miRNA芯片數(shù)據(jù)、miRNA功能、miRNA關(guān)聯(lián)疾病等。為更進(jìn)一步了解Hsa-miR-1的生物學(xué)特征和功能，本研究分析了各物種miR-1的序列，發(fā)現(xiàn)成熟體 miR-1的5'端種子序列具有高度保守性。miRNA主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，其5'端2～8個(gè)核苷酸被稱為種子序列，對(duì)于其功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要，種子序列主要通過與靶mRNA 3'端區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別靶基因，負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)［14］。在同源性miRNA中，這段序列通常是保守的，本研究中的序列比對(duì)分析也證實(shí)了此點(diǎn)。Hsa-miR-1在物種進(jìn)化過程中的高度保守性，提示其在生命過程中可能發(fā)揮了重要功能。

已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA多位于腫瘤相關(guān)的染色體區(qū)域［15］，Hsa-miR-1 所處 染 色體也出 現(xiàn) 斷點(diǎn)［16～18］。本研究中靶基因預(yù)測(cè)出現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的基因富集群，提示其可能參與了人類腫瘤的發(fā)生;ESCC細(xì)胞株Hsa-miR-1表達(dá)水平顯著下調(diào)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦進(jìn)一步證實(shí)了生物信息學(xué)的推測(cè)。由于單個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件具有一定局限性，且每個(gè)預(yù)測(cè)軟件的結(jié)果也不盡相同，本研究同時(shí)采用多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)Hsa-miR-1靶基因結(jié)果、取交集，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)的靶基因進(jìn)行分析，進(jìn)一步提高了預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究中GO分析顯示，Hsa-miR-1的靶基因可能參與細(xì)胞形成過程的代謝和調(diào)控，通路分析表明其靶基因集合顯著富集在癌癥通路、與癌癥發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路以及心肌通路中。提示HsamiR-1可能參與惡性腫瘤及心臟疾病的發(fā)生機(jī)制。

總之，Hsa-miR-1可能參與了食管癌的發(fā)病機(jī)制，其預(yù)測(cè)靶基因集合富集于多個(gè)生物學(xué)過程且顯著富集于癌癥通路;此為后續(xù)Hsa-miR-1生物學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

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