阿托伐他汀對慢性肺心病緩解期患者循環(huán)EPCs、肺功能及血漿hs-CRP、IL-8的影響

(聊城市人民醫(yī)院，山東聊城 252000)

低氧性肺動脈高壓(Hypoxic pulmonary artery hypertension，HPH)是臨床常見的病理生理過程，是慢性阻塞性肺疾病(COPD)等多種心肺疾病發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，其主要病理改變?yōu)榉窝軆?nèi)皮功能失調(diào)和肺血管重建。肺細(xì)小動脈內(nèi)皮損傷、管腔狹窄或堵塞及肺小動脈儲備數(shù)量的減少在HPH發(fā)生、發(fā)展過程中起非常重要的作用［1］，促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)和血管新生可能是一種有效的治療策略。此外，HPH的發(fā)病與氣道、肺實質(zhì)、肺血管的慢性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在肺組織內(nèi)增多;激活的炎癥細(xì)胞釋放一系列炎性介質(zhì)，包括IL-8、高敏-C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和其他能夠破壞肺組織結(jié)構(gòu)的介質(zhì)。近年研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是能直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程［2，3］;他汀類藥物還有改善內(nèi)皮功能、抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種獨(dú)立于調(diào)脂作用外的功能［4］。2008年9月～2010年12月，我們觀察了阿托伐他汀對慢性肺源性心臟病(肺心病)緩解期患者循環(huán)EPCs數(shù)量、黏附及遷移功能與肺功能的影響，旨在為慢性肺心臟病的干細(xì)胞治療及藥物治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期于我院確診的慢性肺心病患者68例，男43例，女25例;年齡60～87(64.9±8.2歲，病程9～27 a。均符合1997年全國第2次肺源性心臟病專業(yè)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，血?dú)夥治鲲@示PaO2為(7.42 ±0.73)kPa，PaCO2為(8.35 ±0.41)kPa。納入標(biāo)準(zhǔn):處于疾病穩(wěn)定期，即第1秒用力呼氣容積(FEV1)占預(yù)計值百分比≤65%、FEV1/用力肺活量(FVC)≤70%，肺動脈收縮壓＞30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa);年齡≥60歲;按美國紐約心臟病學(xué)會NYHA分級方案心功能Ⅰ～Ⅱ級。排除標(biāo)準(zhǔn):心臟瓣膜病、先天性心臟病、外傷、潰瘍、視網(wǎng)膜病、近期外科手術(shù)、急性炎癥、腫瘤及慢性肝、腎疾病史者，近3個月有急性心肌梗死發(fā)生。將68例患者隨機(jī)分為治療組33例和對照組35例。另選擇本院同期健康體檢者30例為正常組，其中男17例、女13例，年齡 60～85(62.4±9.3)歲。三組性別、年齡等一般資料具有可比性。

1.2 治療方法 68例慢性肺心病患者均予鼻導(dǎo)管持續(xù)低流量吸氧、控制呼吸道感染、止咳化痰、平喘等治療(見表1)，在此基礎(chǔ)上治療組加用阿托伐他汀20 mg口服，每晚1次，連續(xù)治療6個月。

表1 68例慢性肺心病患者的基線治療(例)

1.3 臨床指標(biāo)觀察

治療組及對照組分別于治療前及治療后6個月，正常組于入組后次日檢測下列指標(biāo)(全部血漿標(biāo)本的采集均在空腹、靜臥狀態(tài)下進(jìn)行)。

1.3.1 循環(huán)EPCs數(shù)量及遷移、黏附能力 ①EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定:采用密度梯度離心法從受試者外周靜脈血中分離單個核細(xì)胞(MNC)，將其接種于包被有人纖維連接蛋白(HFN)的24孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)至第7天，分離貼壁細(xì)胞，加入DiL標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL-DiL)，37℃溫育1 h，多聚甲醛固定，PBS浸洗，再加入FITC標(biāo)記的荊豆凝集素I(FITC-UEA-I)，溫育1 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察，攝取acLDL-DiL并結(jié)合FITC-UEA-I(即雙染色陽性)者為正在分化的EPCs。②EPCs數(shù)量:采用集落形成試驗。在6孔板每孔置入5×106個MNC，孵育2 d時收集未貼壁細(xì)胞(包括EPCs)，置入24孔板中，調(diào)整密度為1×106細(xì)胞/孔，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，計數(shù)每個樣本中每孔的克隆數(shù)。③EPCs黏附能力:消化、收集培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，將同等數(shù)目的EPCs接種在24孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)30 min，用PBS洗去未貼壁的細(xì)胞，計數(shù)貼壁細(xì)胞。④EPCs遷移能力:消化、收集培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，將EBM-2培養(yǎng)液加入改良Boyden小室的下室，將 2×104個 EPCs懸浮在EBM-2培養(yǎng)基后注入上室，37℃培養(yǎng)24 h，刮去濾膜上面未移動的細(xì)胞，用甲醇固定，Giemsa染色，隨機(jī)選擇3個顯微鏡視野，計數(shù)遷移到底層的細(xì)胞。

1.3.2 肺功能、肺動脈壓(PAP) 應(yīng)用QuarkPFT4肺功能儀(意大利COSMED公司)測定肺功能指標(biāo)FEV1及FVC;采用PhilipiE33彩色多普勒超聲儀測定三尖瓣反流速度(V)，用Bernoulli(柏努利)公式計算 PAP，PAP=4V2。

1.3.3 血漿hs-CRP、IL-8水平 采用 ELISA 法，嚴(yán)格按試劑說明書檢測血漿hs-CRP、IL-8水平。hs-CRP試劑盒購自北京晶美生物工程有限公司，IL-8試劑盒購自eBioscience公司。

1.3.4 不良反應(yīng) 主要包括血清AST、肌酸激酶升高及肌痛等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)以±s表示，均數(shù)間比較用方差分析、成組t檢驗或配對t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 循環(huán)EPCs數(shù)量及遷移、黏附能力 分離獲得的MNC培養(yǎng)7 d后形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞，具有EPCs的特性，可吞噬acLDL-DiL，結(jié)合凝集素后在倒置熒光顯微鏡下分別顯示紅色和綠色、雙染色后呈黃色。治療組和對照組治療前循環(huán)EPCs數(shù)量及遷移、黏附能力均無顯著差異，但兩組均顯著低于正常組(P均＜0.01);治療后治療組上述指標(biāo)均顯著升高，且顯著高于對照組(P均＜0.05)，見表2。

2.2 肺功能及PAP、hs-CRP、IL-8水平 治療前治療組和對照組肺功能指標(biāo)及PAP、hs-CRP、IL-8比較P＞0.05，但兩組血漿 hs-CRP、IL-8 水平、PAP 均顯著高于正常組(P均 ＜0.01)，F(xiàn)VC、FEV1、FEV1/FVC等肺功能指標(biāo)顯著低于正常組(P均＜0.01);治療后治療組FEV1、FEV1/FVC等肺功能指標(biāo)明顯升高(P＜0.05)，PAP、hs-CRP、IL-8 較同組治療前和對照組均有明顯降低(P均＜0.05)，見表3。

2.3 不良反應(yīng) 治療組口服阿托伐他汀期間1例出現(xiàn)AST升高2.8倍，1例出現(xiàn)肌痛、肌酸激酶升高2.2倍，停藥后均降至正常。

表2 三組循環(huán)EPCs數(shù)量及遷移、黏附能力比較(±s)

表2 三組循環(huán)EPCs數(shù)量及遷移、黏附能力比較(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.01;與同組治療前及對照組治療后比較，#P ＜0.05

組別 n EPCs數(shù)量(克隆形成數(shù))遷移能力(遷移EPCs/視野)黏附能力(黏附EPCs/視野)治療組33治療前 13.9 ±3.8* 10.4 ±3.2* 11.3 ±2.3*治療后 18.2 ±4.7# 15.4 ±3.8# 16.9 ±4.5#對照組 35治療前 14.6 ±4.3* 11.3 ±3.7* 10.8 ±3.1*治療后 15.2 ±5.1 11.0 ±3.6 11.7 ±4.6正常組30 25.7 ±5.3 23.9 ±4.8 24.6 ±5.4

表3 三組肺功能、PAP及hs-CRP、IL-8比較(±s)

表3 三組肺功能、PAP及hs-CRP、IL-8比較(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.01;與同組治療前及對照組治療后比較，#P＜0.05

組別 n FEV1(L) FVC(L) FEV1/FVC(%) PAP(mmHg) hs-CRP(mg/L) IL-8(ng/L)治療組33治療前 0.80 ±0.13* 1.44 ±0.21* 55.56 ±4.82* 52.73 ±8.11* 3.96 ±0.31* 136.32 ±13.93*治療后 0.85 ±0.12# 1.46 ±0.26 58.13 ±4.51# 45.37 ±6.84# 1.59 ±0.39# 50.43 ± 6.77#對照組 35治療前 0.81 ±0.11* 1.45 ±0.25* 55.86 ±4.46* 51.66 ±7.93* 3.81 ±0.35* 120.86 ±13.17*治療后 0.81 ±0.24 1.44 ±0.23 56.25 ±4.93 49.14 ±7.28 2.46 ±0.28 79.38 ± 7.70正常組 30 2.78 ±0.47 3.42 ±0.56 81.28 ±6.27 15.28 ±3.75 0.46 ±0.07 19.44 ± 2.86

3 討論

HPH是COPD發(fā)病過程中的中心環(huán)節(jié)，肺動脈高壓的產(chǎn)生及嚴(yán)重程度可明顯影響COPD和肺心病患者的病程及預(yù)后。近年來研究表明，內(nèi)皮功能障礙在HPH的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，HPH患者存在肺血管器質(zhì)性、功能性改變以及肺血管重構(gòu)。EPCs是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，也未形成血管的前體細(xì)胞。早期EPCs主要促進(jìn)細(xì)胞歸巢，分泌生長因子促進(jìn)新生血管形成;而晚期EPCs則主要分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，直接對血管形成起作用，更適合移植、促進(jìn)新生血管形成［5］。鑒于此，EPCs在HPH中的作用也引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。新近研究證實，對于肺血管重構(gòu)不可逆的肺動脈高壓患者，其外周血 EPCs的數(shù)量以及活性存在明顯下調(diào)［6，7］。劉海峰等［8］發(fā)現(xiàn)，隨 COPD患者 PAP增高，外周血EPCs數(shù)量減少、黏附和遷移能力降低，肺小動脈自身修復(fù)能力降低。目前針對肺動脈高壓的治療存在下列局限:降低肺循環(huán)血壓的藥物對體循環(huán)血壓也有降低作用，易導(dǎo)致全身性不良反應(yīng)［9］;血管內(nèi)皮素、前列腺素等藥物價格高，長期應(yīng)用增加患者負(fù)擔(dān)。對COPD所致肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈高壓的發(fā)生與多種細(xì)胞因子參與的炎癥反應(yīng)有關(guān)，缺氧、自身免疫性抗體、病原微生物等多種因素均可導(dǎo)致促炎癥因子表達(dá)升高，激活炎癥細(xì)胞和下游的信號傳導(dǎo)通路啟動增殖過程和炎性病變［10］;同時，有研究表明COPD患者在低氧血癥和肺功能降低前就已出現(xiàn)肺血管的改變，以血管周圍炎性細(xì)胞浸潤為主要特征［11］。上述研究結(jié)果提示，可以針對COPD患者的全身性非特異性炎癥進(jìn)行治療，從而降低PAP。

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，通過競爭性抑制HMGCoA還原酶活性減少內(nèi)源性膽固醇合成，提高受體介導(dǎo)的血漿低密度脂蛋白清除率，有效調(diào)節(jié)血脂，廣泛用于各類人群的降脂治療;且冠心病患者長期服用無明顯不良反應(yīng)，具有高效和安全的特點(diǎn)。近年來，越來越多的證據(jù)顯示他汀類藥物具有擴(kuò)張血管、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、改善內(nèi)皮功能、促進(jìn)血管新生、抑制炎癥反應(yīng)等獨(dú)立于其調(diào)脂以外的血管保護(hù)作用［12，13］。Satoh 等［14］用他汀類藥物對低氧 5 周的肺動脈高壓大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可通過抑制SDF-la/CXCR4和ICAM-1/CD18途徑減少骨髓來源EPCs的動員及歸巢，從而降低 PAP。Schomig等［15］在急性心肌梗死患者中觀察到，外周血循環(huán)EPCs數(shù)量與是否使用他汀類藥物治療呈正相關(guān)。CRP是炎癥和感染等癥狀的一個臨床標(biāo)記物，可與受損的細(xì)胞結(jié)合，通過激發(fā)補(bǔ)體加重組織損傷處的炎癥反應(yīng)。IL-8是由巨噬細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞合成的重要細(xì)胞趨化因子，可吸引中性粒細(xì)胞，促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-8基因表達(dá)，導(dǎo)致IL-8進(jìn)一步分泌，形成血管的炎性循環(huán)。新近研究表明，辛伐他汀可通過抑制野百合堿(MCT)誘導(dǎo)肺動脈高壓模型大鼠肺組織中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及下調(diào)炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8的分泌，發(fā)揮對肺動脈高壓的治療作用［16］。本研究顯示，治療組和對照組治療前EPCs的數(shù)量及遷移、黏附能力均顯著低于正常組，PAP及血漿hs-CRP、IL-8水平均顯著高于正常組。提示EPCs數(shù)量減低、功能障礙及炎癥反應(yīng)同時參與了慢性肺心病所致HPH的病理生理過程。本研究還顯示，治療后治療組EPCs數(shù)量及遷移、黏附能力明顯升高，F(xiàn)EV1、FEV1/FVC等肺功能指標(biāo)明顯改善，PAP及血漿hs-CRP、IL-8水平明顯下降，與治療前及對照組治療后比較均有顯著差異;治療組不良反應(yīng)輕微，停藥后均能恢復(fù)。提示阿托伐他汀可能通過增加EPCs數(shù)量及改善其功能促進(jìn)肺血管損傷內(nèi)皮的修復(fù)、抑制血管炎性反應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到治療肺動脈高壓、改善肺功能等作用，且安全性高。

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