靶向VEGF的shRNA對皮膚鱗癌A431細(xì)胞的作用

曹一鑫，馮 新，王建力，陳 莉

(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇南通226001;2.海門市皮膚病防治醫(yī)院;3.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，江蘇南通 226001)

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，從基因水平上探索防治皮膚鱗癌的新途徑已日益成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其中RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是目前最有希望攻克腫瘤的方法之一［1－2］，將為皮膚鱗癌未來的臨床治療開辟一個(gè)新的領(lǐng)域。本研究擬通過RNAi技術(shù)沉默人皮膚鱗癌細(xì)胞系(A431細(xì)胞)中VEGF基因，觀察癌細(xì)胞增殖、遷移和黏附的改變，為進(jìn)一步開發(fā)以VEGF基因?yàn)榘悬c(diǎn)的皮膚鱗癌基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人皮膚鱗癌細(xì)胞(A431)由西安第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院高天文教授惠贈(zèng)。PCR Maker(Tiangen公司);脂質(zhì)體(Invitrogen公司)，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司)，PCR試劑盒、DNA連接試劑盒、分子質(zhì)量標(biāo)記和限制性內(nèi)切酶(寶生物工程有限公司)。EILSA試劑盒、FN、鼠抗VEGF單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體(Santa Cruz公司)，CCK-8(日本同仁公司)，Transwell小室(Coastar公司)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建:利用Qiagen siRNA設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)基因庫中的VEGF序列設(shè)計(jì)2個(gè)靶位點(diǎn)的VEGF shRNA序列(55 nt的寡核苷酸)［3］。通過真核表達(dá)載體pSilencer4.1-CMVneo構(gòu)建靶向VEGF基因的shRNA表達(dá)載體(psilencer-VEGF-shRNA，VEGF-s1和VEGF-s2)。同法構(gòu)建與人類任何基因序列均無同源關(guān)系的隨機(jī)靶序列作為陰性對照表達(dá)質(zhì)粒(Target-off-shRNA，T-off)，設(shè)計(jì)質(zhì)粒序列見表1。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法:取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至90% ～95%匯合時(shí)，參照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。設(shè)未轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞為對照組(N)。1)實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(real-time qutant RT-PCR，RT-QPCR)檢測A431細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)，VEGF引物序列:上游:5'-ATGCGGATCAAACCTCACCA-3'，下游:5'-TTACACGTCTGCGGATCTTG-3'，內(nèi)參GAPDH引物序列……