新城疫病毒感染活化的人肝星狀細胞系LX-2

李亞琳

(渭南師范學院化學與生命科學學院，陜西渭南 714000)

新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)是單股負鏈RNA病毒，具有天然的在腫瘤細胞選擇性復制的特點。現在有一種觀點認為，NDV也可以在活化的非正常轉化細胞中高效復制。早在1976年就有報道，NDV能夠在活化的T細胞中復制，并導致活化T細胞的死亡;后來又有報道證明，NDV能夠在非正常轉化細胞中高效復制［1］。

肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝臟的非實質細胞，其活化是肝纖維化發生的主要原因，而肝纖維化是肝癌前病變的重要病理階段。因此著眼于活化HSC的靶向治療是抑制肝纖維化，改善肝癌狀況的一個新的研究熱點［2］。由于活化HSC也是一種非正常的、具有增殖能力的轉化細胞，本實驗以該細胞為出發點，探討溶瘤NDV在活化HSC中的復制情況，為肝纖維化治療以及肝癌的預防提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒

人肝星狀細胞系LX-2(美國Mount Sinai醫學院Scott L.Friedman教授饋贈);重組NDFLtag-EGFP和溶瘤株 NDV-Italien(德國癌癥研究中心 Volker Schirrmacher教授饋贈)。NDFLtag-EGFP是由NDV LaSota株經過反向遺傳技術獲得，能夠表達增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorecence protein，EGFP)。

1.2 主要試劑

DMEM培養基(Hycolon公司);新生牛血清(中國杭州四季青公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);ReverTra Ace-α-TM(Toyobo公司);Taq DNA 聚合酶(TaKaRa公司);α-SMA、COLLAGENⅠ、TGF-β1 以及GAPDH引物(上海生工生物工程技術服務有限公司合成);重組人 TGF-β1(PeproTech Asia公司);雞抗NDV-HN一抗和兔抗雞IgY-FITC二抗(USBiological公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及條件培養基的制備:LX-2和小鼠原代培養HSC于37℃、5%CO2及飽和濕度下分別用DMEM(含5%或10%NBCS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)在培養箱中培養。

1.3.2 病毒的制備:將10 000 HU的NDV-Italien和NDFLtag-EGFP，按104～106倍稀釋，接種9～10日齡(溫度37℃，濕度60% ～65%的孵箱孵育9～10日)的無特異病原體(specific pathogens free，SPF)雞胚(梅里亞維通實驗動物技術有限公司，北京)，每只雞胚注射100 μL病毒到尿囊腔。……