IL-1通過(guò)PKC/MAPK激活蛋白激酶通路上調(diào)泡沫細(xì)胞ACAT-1的表達(dá)及活性

王庸晉，王治平，魏 武，周勝華

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院1.附屬和平醫(yī)院心內(nèi)科;2.心血管病研究所;3.內(nèi)科學(xué)教研室，山西長(zhǎng)治046000;4.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙 410011)

脂酰CoA膽固醇酯酰轉(zhuǎn)移酶-1(ACAT-1)是調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇代謝平衡的關(guān)鍵蛋白之一，在動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)發(fā)生的早期起重要作用。IL-1是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的始動(dòng)因素，可誘發(fā)包括AS在內(nèi)的多種心血管疾?。?］。前期研究發(fā)現(xiàn)IL-1可上調(diào)單核細(xì)胞向泡沫細(xì)胞分化過(guò)程中ACAT-1的表達(dá)及酶活性［2－3］。另有研究證實(shí)，IL-1可通過(guò)絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路導(dǎo)致炎性反應(yīng)，蛋白激酶C(PKC)可直接磷酸化MAPK上游的原癌基因產(chǎn)物raf-1，從而激活ras介導(dǎo)的MAPK活化［4］。本研究旨在觀察IL-1是否通過(guò)PKC/MAPK信號(hào)通路上調(diào)泡沫細(xì)胞中ACAT-1的表達(dá)及活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系/THP-1細(xì)胞(武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心)。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組:細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640的完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，根據(jù)干預(yù)因素不同設(shè)置3個(gè)組:泡沫細(xì)胞組(巨噬細(xì)胞+Ox-LDL培養(yǎng)24 h，F(xiàn)C組)、泡沫細(xì)胞+IL-1組(巨噬細(xì)胞+Ox-LDL+IL-1培養(yǎng)24 h，F(xiàn)C+IL-1組)、泡沫細(xì)胞加IL-1/Anti-IL1組(巨噬細(xì)胞+Ox-LDL+IL-1+Anti-IL1培養(yǎng)24 h，F(xiàn)C+IL-1+Anti-IL1組)。1.1.3 主要試劑:RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco BRL公司)，乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)(Calbiochem公司)，IL-1 alpha(蛋白)與 IL-1 alpha(抗體)(AMS公司)，低密度脂蛋白(AppliChem公司)，Tris-Base、SDS、膽固醇油酰酯、油酰 CoA和 Triton WR-1339等(Sigma公司)，PKC抑制劑 GF109203和MAPK抑制劑Apigenin(上海吉泰生物科技有限公司)，PepTag蛋白激酶C活性檢測(cè)試劑盒(Progema公司)，MAPK及ACAT-1單克隆抗體(Santa Cruz公司)，二抗稀釋液(湖南省力欣生物科技公司)，油紅O(湖南歐邁生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 主要細(xì)胞培養(yǎng)液體的配制:1)PMA的配制:加DMSO溶解PMA粉劑為終濃度100 mmol/L的PMA 原液，取原液10 μL加入 DMSO 240 μL，得到終濃度為4 mmol/L的PMA工作液。每毫升培養(yǎng)基加PMA工作液5 μL為終濃度200 nmol/L。2)氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)的制備:將LDL置于無(wú)EDTA的0.01 mol/L，pH 7.4的 PBS溶液中透析40 h，然后加入含CuSO4的PBS溶液中(Cu2+終濃度為5 μmol/L)37℃氧化24 h。氧化結(jié)束后，加入含有EDTA(終濃度為10 μmol/L)的PBS溶液中透析24 h，4℃避光保存。BCA法測(cè)定Ox-LDL的濃度以確定LDL的氧化程度。

1.2.2 油紅O染色:細(xì)胞爬片取出，PBS沖洗3次，濾紙吸去多余水分;10%中性甲醛固定10 min，油紅O液中染3～5 min;60%異丙醇洗去多余染液，PBS沖洗3次;蘇木素復(fù)染10～15 min，1%鹽酸分色及返藍(lán)10 s，蒸餾水洗3次;甘油明膠封固，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.3 PKC活性檢測(cè):常規(guī)RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白并采用Bradford法測(cè)定總蛋白的濃度。采用非放射性酶法PepTag蛋白激酶C活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PKC活性。原理如下:PKC作用于底物后，磷酸化的底物向正極泳動(dòng)，而未磷酸化的底物向負(fù)極泳動(dòng)，利用電泳瓊脂糖凝膠技術(shù)顯示2種不同蛋白，將顯示的不同蛋白定量，以磷酸化PKC與非磷酸化PKC灰度值的比值表示PKC的活性。

1.2.4 Western blot各組細(xì)胞蛋白質(zhì)提取:取出所需細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液100 μL;冰上放置20 min后，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到離心管中;4℃，12 000 ×g離心20 min，吸取上清液。取上清液3 μL-i-DEPC 水57 μL(即稀釋20 倍)+考馬斯亮藍(lán)G-250 3 mL，充分搖勻約15 min，同時(shí)以考馬斯亮藍(lán)G-250 3 mL作為空白對(duì)照，用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，其余蛋白80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?jīng)制膠、樣品制備、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、抗原抗體反應(yīng)及顯跡等操作步驟，最后以凝膠成像分析系統(tǒng)攝像并分析。

1.2.5 ACAT-1活性檢測(cè):用低張休克法［5］獲取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。酶反應(yīng)液中包括100 μg待測(cè)蛋白、1 mg BSA、游離膽固醇和 Triton WR-1339(20 μg∶600 μg); 加0.1 mmol/L 磷 酸鉀 緩 沖液(pH 7.4，含10 mmol DTT) 至180 μL，37℃孵育30 min后加入20 μL〔1-14C〕油酰CoA溶液 (用未標(biāo)記的油酰CoA，3.7×105Bq，反應(yīng)體系終濃度為20 μmol/L)37℃ 孵育10 min，加入氯仿∶甲醇(2∶1，V/V)終止反應(yīng)，加入0.8 mL水使有機(jī)相分離;取下層相液體 (氯仿相)進(jìn)行薄層層析，展層系統(tǒng)為正己烷∶已醚∶冰已酸 (V∶V∶V)=170∶30∶1，以膽固醇油酰酯作對(duì)照，用碘蒸氣顯色后剪下膽固醇斑點(diǎn) (Rf=0.71)放入裝有5 mL閃爍液中，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)酶活性［酶活性單位為nmol/(mg·min)］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(±s)，各組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計(jì)采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 泡沫細(xì)胞的誘導(dǎo)建立

THP-1單核細(xì)胞呈圓形、懸浮式、非貼壁形式生長(zhǎng)(圖1A);經(jīng)PMA誘導(dǎo)48 h后，細(xì)胞體積增大，由圓形變成卵圓形、梭形、不規(guī)則形，貼壁式生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞(圖1B);經(jīng)Ox-LDL誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，細(xì)胞膜突觸形成明顯，胞質(zhì)增加，疏松化，可見(jiàn)大量脂質(zhì)小滴;經(jīng)油紅O染色后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)紅染物質(zhì)(圖1C)。

2.2 PKC活性檢測(cè)結(jié)果

FC+IL-1組PKC活性為0.959±0.02，顯著高于FC組的0.618±0.01(P＜0.05)，F(xiàn)C+IL-1+Anti-IL1組PKC活性為0.593±0.02顯著低于FC+IL-1組(P＜0.05)(圖2)。

2.3 MAPK蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

FC+IL-1組磷酸化的MAPK蛋白表達(dá)為0.773±0.02顯著高于FC組0.601±0.01(P＜0.05)，F(xiàn)C+IL-1+Anti-IL1組磷酸化的MAPK蛋白表達(dá)為0.558±0.01顯著低于FC+IL-1組(P＜0.05)(圖3)。

2.4 PKC抑制劑和MAPK抑制劑對(duì)ACAT-1蛋白表達(dá)的影響

各組中加抑制劑前后相比，3組細(xì)胞ACAT-1蛋白表達(dá)均下調(diào)(P＜0.05)(表1，圖4，5)

圖1 3種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化Fig 1 Morphological changes of three cells(×400)

2.5 PKC和MAPK抑制劑對(duì)ACAT-1酶活性的影響

各組中加抑制劑組前后相比，3組細(xì)胞的ACAT-1酶活性均明顯下調(diào)(P＜0.05)(表1)。

3 討論

ACAT是細(xì)胞內(nèi)唯一催化膽固醇與長(zhǎng)鏈脂肪酸酯化形成膽固醇酯的酶，它在生物體吸收、運(yùn)輸和儲(chǔ)存膽固醇過(guò)程中起著極其重要的作用［6］，在單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)主要以ACAT-1的形式存在［7］。研究發(fā)現(xiàn)，在AS斑塊分離的泡沫細(xì)胞中，膽固醇酯的合成速率及ACAT-1的活性明顯增加［8］。泡沫細(xì)胞中的膽固醇酯富含油酰膽固醇，主要通過(guò)膽固醇酯循環(huán)由ACAT-1催化重新合成［9］。ACAT-1活性增高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯合成速率增加，含量增多，單核-巨噬細(xì)胞隨之向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本研究以人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系/THP-1細(xì)胞為模型，經(jīng)PMA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，繼續(xù)經(jīng)Ox-LDL作用后，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為膽固醇酯并發(fā)生聚積，最終轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。

表1 PKC抑制劑和MAPK抑制劑對(duì)ACAT-1蛋白表達(dá)及酶活性的影響Table 1 Effects of PKC inhibitor and MAPK inhibitor on the expression of ACAT-1 protein and active［±s，nmol/(mg·min)，n=6］

表1 PKC抑制劑和MAPK抑制劑對(duì)ACAT-1蛋白表達(dá)及酶活性的影響Table 1 Effects of PKC inhibitor and MAPK inhibitor on the expression of ACAT-1 protein and active［±s，nmol/(mg·min)，n=6］

*P＜0.05 compared with foam cells;#P＜0.05 compared with the control group respectively.

group ACAT-1 protein ACAT-1protein ACAT-1 active foam cells 0.607±0.01 0.813±0.02 4.92±0.11 foam cells+PKC inhibitor 0.413±0.03# 2.47±0.01#foam cells+MAPK inhibitor 0.633±0.03# 2.33±0.06#foam cells+IL-1 0.799±0.04 1.099±0.04 5.95±0.12*foam cells+IL-1+PKC inhibitor 0.649±0.02# 2.52±0.22#foam cells+IL-1+MAPK inhibitor 0.748±0.03# 2.28±0.99#foam cells+IL-1+Anti-IL-1 0.592±0.03 0.580±0.03 2.34±0.10 foam cells+IL-1+Anti-IL-1+PKC inhibitor 0.487±0.01# 2.11±0.07#foam cells+IL-1+Anti-IL-1+MAPK inhibitor 0.429±0.02# 2.56±0.04#

IL-1又稱淋巴細(xì)胞激活因子，主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，其主要功能是激活淋巴細(xì)胞，參與炎性反應(yīng)。在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，IL-1可促使單核細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但作用機(jī)制不明確［1］。前期研究發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中，IL-1可上調(diào) ACAT-1的表達(dá)及酶活性［2－3］。有研究證實(shí)，IL-1可通過(guò) MAPK 信號(hào)通路導(dǎo)致炎性反應(yīng)，PKC可直接磷酸化MAPK上游的原癌基因產(chǎn)物raf-1，從而激活 ras介導(dǎo)的 MAPK活化［10］。本研究通過(guò)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型，進(jìn)一步探討IL-1是否能通過(guò)PKC/MAPK信號(hào)通路上調(diào)泡沫細(xì)胞中ACAT-1的表達(dá)及活性。結(jié)果顯示，與泡沫細(xì)胞相比，泡沫細(xì)胞加IL-1組ACAT-1的表達(dá)增加、活性升高，PKC及MAPK活性增加，而泡沫細(xì)胞加IL-1/Anti-IL1組中ACAT-1的表達(dá)、活性，PKC及MAPK活性均無(wú)明顯變化。表明IL-1能夠增加泡沫細(xì)胞中ACAT-1的表達(dá)及活性，同時(shí)上調(diào)泡沫細(xì)胞中PKC及MAPK的活性。PKC抑制劑GF109203，MAPK抑制劑Apigenin可分別抑制PKC和MAPK的磷酸化而抑制其活性［11－12］。結(jié)果顯示，與各自對(duì)照組相比，加 PKC 或MAPK抑制劑后，ACAT-1的表達(dá)及活性明顯下調(diào)，從而表明IL-1上調(diào)泡沫細(xì)胞中ACAT-1的表達(dá)及活性的作用可能是通過(guò)PKC/MAPK信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。但由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑十分復(fù)雜，一條通路可同時(shí)被多種因子激活，而一種因子亦可同時(shí)激活多條信號(hào)通路。因此，對(duì)IL-1在泡沫細(xì)胞中上調(diào)ACAT-1表達(dá)及活性的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制尚需進(jìn)行更為深入的研究。

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