小鼠外周組織時鐘基因啟動子區(qū)甲基化分析

林慶玲，蔡彥寧，袁艷鵬，左曉虹

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)生物室，教育部神經(jīng)變性病學重點實驗室，北京 100053)

迄今哺乳動物多個時鐘基因得到了鑒定，包括BMAL1、BMAL2、CLOCK、NPAS2、PER1、PER2、CRY1、CRY2及REV-ERBα等。時鐘基因對于生物節(jié)律的產(chǎn)生和維持發(fā)揮重要作用［1］。哺乳動物時鐘基因的節(jié)律表達不僅存在于視交叉上核，還存在于外周組織中如心、肝、腎、脾等［2-3］。PER1/PER2，CRY1/CRY2，CLOCK/NPAS2是旁系同源對。同時敲除旁系同源的兩個基因引起小鼠的晝夜節(jié)律喪失［4］。時鐘基因表觀遺傳調控在外周組織、癌細胞、腫瘤樣品以及圍產(chǎn)期發(fā)育中都有所研究［5-8］，這些研究表明，DNA甲基化可能調控正常機體發(fā)育和腫瘤發(fā)生中時鐘基因的表達。此外，時鐘基因甲基化狀態(tài)與路易體癡呆和老化有關［9-10］。

甲基化特異性聚合酶鏈式反應(methylationspecific polymerase chain reaction，MSP)是一種鑒定啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的簡單快速的方法［11］。而今未有關于小鼠時鐘基因啟動子區(qū)甲基化的報道，而小鼠是研究人類發(fā)育和老化必不可少的模型，所以應用MSP方法對小鼠時鐘基因啟動子區(qū)進行甲基化檢測非常有意義。本實驗設計了兩套MSP鑒定小鼠時鐘基因啟動子區(qū)甲基化，檢測了小鼠5個外周組織 8 個時鐘基因 PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、NPAS2、BMAL1和BMAL2啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

QIAamp DNA mini kit(Qiagen，CA公司);Wizard DNA purification resin(Promega，Madison，WI公司);HS Taq(Takara公司);GelRed(Biotium，CA公司);SssI(CpG甲基化酶New England Biolab公司);引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 動物

清潔級C57BL/6雄性小鼠5只，8周齡，體質量18～20 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK-(軍)-2007-004。按如下條件飼養(yǎng)2 周:飲食、飲水自由，08∶00開燈，20∶00關燈，照明:黑暗時間為12 h∶12 h。動物處理按照美國國立衛(wèi)生研究院動物實驗指導方針和首都醫(yī)科大學實驗動物照料和使用委員會指導方針。……