阿托伐他汀對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦組織TIM—3、TIM—1表達的影響

唐海洋 譚利明

【摘要】目的：觀察阿托伐他汀對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE）Wistar大鼠的發病情況、組織病理變化及腦組織內T細胞免疫球蛋白和黏液域蛋白-3（TIM-3）、T細胞免疫球蛋白和黏液域蛋白-1（TIM-1）表達水平的影響。方法：將30只雌性Wistar大鼠隨機分為佐劑組、EAE組、阿托伐他汀組，以豚鼠脊髓勻漿（GPSCH）誘發制備大鼠EAE模型，并于給予GPSCH當日開始1次/d灌服0.1%PBS溶液1.5ml/只（佐劑組和EAE組）和含阿托伐他汀的0.1%PBS溶液，1次/d，劑量為8mg/（kg·d），連續13d，觀察EAE癥狀并評分，用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測Tim-1mRNA、Tim-3mRNA在腦組織中的表達。結果：阿托伐他汀組發病率降低、臨床癥狀減輕，體重下降減少（P<0.05）；與佐劑組比較，EAE組TIM-3mRNA明顯上升（P<0.05），阿托伐他汀組TIM-3mRNA較EAE組明顯下降（P<0.05）；與佐劑組比較，EAE組TIM-1mRNA下降（P<0.05），阿托伐他汀組TIM-1mRNA較EAE組上升（P<0.05）。結論：EAE大鼠TIM-3上升，TIM-1下降，提示其在EAE發病機制中發揮作用，通過下調TIM-3、上調TIM-1的表達，可能是阿托伐他汀對EAE保護作用機制之一。

【關鍵詞】實驗性自身免疫性腦脊髓炎；多發性硬化；TIM-3；TIM-1；阿托伐他汀

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE）是以中樞神經系統炎性脫髓鞘為特征的疾病，是研究MS的理想動物模型[1]。T細胞免疫球蛋白和黏液域蛋白（TIM）家族是一類具有免疫調節作用的蛋白，可以作為Th細胞的分化標志[2]。TIM-3是TIM家族中的一員，Monney等[3]研究發現，在體內運用TIM-3特異性抗體使EAE小鼠疾病死亡率增加，中樞神經系統炎癥病灶增多，增加和激活CD11b+細胞。TIM-1最先被發現與變應性哮喘的發生有關[4]。TIM-1選擇性表達于Th2細胞上，在Th1細胞及Th17細胞上沒有表達[5]。目前研究提示，在人體中，TIM-1不僅與過敏性疾病和哮喘有關，在自身免疫性疾病中也起著調節作用，如在類風濕關節炎的產生與TIM-1的外顯子4相關，C反應蛋白與類風濕因子的水平與TIM-1基因的啟動子多態性相關[6]。在MS緩解期患者腦脊液單核細胞上可檢測到TIM-1mRNA的表達，提示TIM-1對MS的恢復具有有益作用，其機制可能與免疫耐受有關[7]。

目前各種能夠緩解EAE病情的免疫調節藥物在MS的治療作用仍在試驗階段，且存在相關的副作用及潛在的毒性作用[8]。最近發現，他汀類藥物除了其調脂作用外，亦存在免疫調節作用使之用于治療中樞神經系統脫髓鞘疾病，如MS的研究越來越多[9]。他汀類藥物運用于MS以及類風濕關節炎等得臨床試驗也已經得到有前景的結果[10]。他汀類藥物的免疫調節作用包括有保護血腦屏障的完整性[11]，抑制中樞神經系統炎癥細胞浸潤[11]，促進Th1細胞反應向Th2細胞反應偏移等[9]。最近發現除外其免疫調節作用外，他汀類藥物對EAE還具有神經保護和促進神經再生的作用[12]。

本實驗從免疫誘導第1天開始予以阿托伐他汀藥物治療，根據國外文獻報道，選擇8mg/（kg·d）作用治療劑量，觀察阿托伐他汀對EAE的治療作用。并通過檢測TIM-3及TIM-1mRNA的表達情況檢測阿托伐他汀是否通過影響其表達對EAE起治療作用。

1材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠30只，6～8周齡，體重（200±20）g，雌性；豚鼠10只，300～400g，雌雄不限。購于湖南農業大學動物科技學院實驗動物養殖場。在中南大學湘雅二醫院動物實驗中心分籠飼養，每籠5只。喂食本醫院動物實驗中心配置的大鼠飼料，飲自來水，保持室溫（18±2）℃，相對濕度（50±10）％，人工光照時間12h/d，自動抽風，每日上午更換食、水和墊料1次，飼養觀察3d，能正常進食和飲水者納入實驗用鼠。

1.2主要試劑阿托伐他汀購自大連輝瑞制藥有限公司，卡介苗（BCG）凍干粉購自北京生物制品研究所，醫用羊毛脂購自重慶化學試劑廠，羅可沙爾堅牢藍購自Sigma公司，RT-PCR試劑盒由Fermentas公司生產，EDTA、Tris購自Sigma公司，引物由上海生物工程技術有限公司生產。

1.3抗原制備完全福氏佐劑（CFA）的配制：取醫用的石蠟油40ml，醫用羊毛脂10g，于三角瓶內充分混合，高溫滅菌30min，制成不完全福氏佐劑。將失活的卡介苗凍干粉60mg用少量生理鹽水溶解加入不完全福氏佐劑中充分混合均勻，制成含卡介苗為6mg/ml的完全福氏佐劑，置于4℃冰箱保存。豚鼠脊髓勻漿（guineapigspinalcordhomogenate，GPSCH）提取和免疫抗原制作：用10％水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉豚鼠處死后，剝出脊髓，去掉馬尾與脊膜并稱重，加入少量無菌冰生理鹽水，用手動勻漿器將其制成50％（質量濃度）的豚鼠脊髓勻漿。取等體積的GPSCH與CFA混勻制成穩定的油包水型乳劑，置于4℃的冰箱保存并于12h內用于誘發EAE。

1.4實驗動物分組及干預處理將30只雌性Wistar大鼠隨機分為三組：佐劑組（CFA）（n=10），用生理鹽水代替免疫抗原，常規飼養，即日開始灌服0.1%PBS溶液，每次灌服液體量1.5ml/只，1次/d；EAE組（n=10），無菌操作下，在Wistar大鼠雙后肢足墊皮下注射GPSCH-CFA乳劑（0.2ml/100g），EAE模型建立后，常規飼養，即日開始灌服0.1%PBS溶液，每次灌服液體量1.5ml/只，1/d次。阿托伐他汀組（n=10），EAE模型建立后常規飼養，即日開始灌服含阿托伐他汀的0.1%PBS溶液，1次/d，劑量為8mg/（kg·d）。

1.5動物行為觀察和神經功能障礙評分將免疫抗原注射日定為第0天，每日稱體重觀察病情并進行神經功能障礙評分。從出現臨床癥狀開始至實驗終止每天按照Benson評分標準進行評分（如下），2次/d。1級：尾部無力或跋踞步態伴尾部有力；2級：蹣跚步態伴尾部無力（共濟失調）；2.5級：共濟失調伴部分單肢麻痹；3級：單肢完全麻痹；3.5級：單肢完全麻痹伴另一肢體部分麻痹；4級：雙肢完全麻痹；4.5級；四肢麻痹；5級：死亡。

1.6動物處死時間和標本處理于大鼠免疫后第13天（相當于EAE組發病高峰期）終止實驗，處死所有大鼠，無菌條件下迅速取出完整腦，留左腦后放入RNase-free的凍存管于液氮環境下保存，以作為提取RNA用。右腦標本放入4%多聚甲醛固定，進行HE染色和LFB染色。

1.7RT-PCR法檢測Tim-3mRNA、Tim-1mRNA表達取保存液氮中的腦組織采取Trizol法提取各樣本總RNA，紫外分光光度計測定濃度并定量后逆轉錄，逆轉錄產物進行PCR反應。根據GenBank中目的基因所對應的cDNA表達序列和提供的相關資料，利用軟件PrimerPremier5.0設計上下游引物：TIM-3：上游引物：5′-CAATTCCCTGGCCCAATGAATGA-3′，下游引物：5′-ACTTCCCTCAGTGGTTAGGGTTCT-3′Tm60℃，產物長度為150bp。TIM-1：上游引物5′-TGGTTGTCACCAGGTACATCA

TTATA-3′，下游引物：5′-TGCGTTCTGCAAAGCTCTACTC-3′Tm56℃，產物長度為170bp。GAPDH：上游引物：5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC-3′，下游引物：5′-GTCTCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′Tm58℃，產物長度為450bp。PCR反應條件見表1。

通過PCR最后確定TIM-3、TIM-1退火溫度（Tm）分別為60℃、56℃，最后按照此條件進行所有樣品的PCR擴展。產物于1%瓊脂凝膠電泳；凝膠成像系統下觀察。

1.8數據分析將圖片采集，并用Qualityone軟件對圖像進行灰度分析。

1.9統計學處理所有統計分析均用SPSS17.0統計軟件包完成，計量資料以（x±s）表示，多組計量資料均數比較用單因素完全隨機方差分析（ANOVA），并做多組間兩兩均數比較（LSD-t檢驗法）。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1實驗大鼠的發病率、體重及神經功能評分變化佐劑組無大鼠發病。EAE組共有8只大鼠發病，發病率為80%，有1只大鼠死亡。阿托伐他汀組共有3只大鼠發病，發病率為30%。佐劑組大鼠體重逐步增加。EAE組各亞組大鼠的體重損失隨病情加重而增加，在發病高峰時體重損失達到最高值。阿托伐他汀組大鼠體重損失較EAE組減少，比較差異有統計學意義（P<0.05）。佐劑組神經功能評分0。EAE組神經功能評分高于阿托伐他汀組（P<0.05）。見表2。

2.2實驗大鼠腦組織的病理學變化佐劑組大鼠CNSHE染色結構清晰，無炎性細胞浸潤（圖3）。EAE組大鼠腦實質內可見血管“袖套”樣改變，亦可見膠質細胞及一定數量的巨噬細胞（圖4）。阿托伐他汀組大鼠腦組織炎性細胞浸潤的程度較EAE組減少（圖5）。LFB染色EAE組可見大片或融合的脫髓鞘灶，甚至軸索染色亦缺失，呈空泡樣改變（圖2）。阿托伐他汀組未見明顯髓鞘脫失。

圖5阿托伐他汀組大鼠側腦室周圍組織未見炎性細胞浸潤×400

2.3RT-PCR結果與佐劑組比較，EAE組TIM-3mRNA上升（P<0.05），阿托伐他汀組TIM-3mRNA較EAE組下降（P<0.05）。與佐劑組比較，EAE組TIM-1mRNA下降（P<0.05），阿托伐他汀組TIM-1mRNA較EAE組上升（P<0.05）。見表3。

3討論

以往EAE被認為是針對自身髓鞘的Th1型反應為主的自身免疫性疾病。近年來越來越多的證據提示，Th17細胞亦參與該疾病的病理過程。最初認為，CD4+效應T細胞分為Th1和Th2細胞兩類。Th1/Th2平衡在EAE的發病機制中起著重要的作用。大多數學者認為，Th1/Th2平衡的偏移導致Th1細胞增多是造成MS發病的關鍵。TIM家族是一類具有免疫調節作用的蛋白，因為其在T細胞上表達情況的不同可以作為Th細胞的分化標志。TIM-3被發現特異性的表達于Th1細胞上，而在Th2細胞上無表達。TIM-1選擇性表達與Th2細胞上，在Th1細胞及Th17細胞上沒有表達。在MS緩解期患者腦脊液單核細胞上可檢測到TIM-1mRNA的表達，提示TIM-1對MS的恢復具有有益作用，其機制可能與免疫耐受有關。綜上所述，TIM-3可作為Th1細胞的分化標志，而TIM-1可作為Th2細胞的分化標志。本實驗通過檢測上述兩個指標間接反應EAE大鼠中Th1細胞和Th2細胞的變化。在EAE大鼠中TIM-3mRNA上升，TIM-1mRNA下降，符合EAE發病過程中Th1型反應增多，同時Th2型反應有所下降，與文獻報道結果一致。

目前大量研究發現，他汀類藥物在體內抑制膽固醇生物合成同時，還具有免疫調節、抗炎及神經保護作用，對某些神經系統自身免疫性疾病如MS，EAE等有治療作用。本實驗中筆者使用阿托伐他汀干預EAE，結果發現，干預后的EAE大鼠發病率、神經功能損傷評分、體重變化等較佐劑組和EAE組大鼠明顯減輕或延遲，病理方面炎性細胞浸潤及脫髓鞘病變亦較EAE組明顯減少。以上結果均證實阿托伐他汀對EAE大鼠的治療作用。HE染色顯示炎性細胞明顯減少，推測其與抑制抑制T淋巴細胞向中樞神經系統遷移，保護BBB完整性，從而減少CNS系統炎性細胞浸潤有關。LFB染色結果脫髓鞘病變少見，證實了阿托伐他汀的神經保護作用，推測其機制可能與抑制促炎性細胞因子誘導的細胞毒素釋放，增強少突膠質干細胞的存活和分化，抑制反應性神經膠質增生，形成有利于髓鞘再生的環境。本實驗還通過測定TIM-3及TIM-1mRNA發現，與EAE比較阿托伐他汀干預后TIM-3表達下降，TIM-1表達上升，提示其能通過減少Th1型反應減少EAE中樞神經系統炎癥反應，并使之向Th2型反應轉化，從而使EAE病情緩解，對EAE產生治療作用。

綜上所述，阿托伐他汀可能是一種有前景的多發性硬化治療藥物。

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（收稿日期：2012-11-14）（本文編輯：王宇）