柚皮苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈PPAR—δ、VCAM—1mRNA表達(dá)的影響

楊穎　袁斌　周春陽(yáng)

【摘要】目的：探討黃酮類化合物柚皮苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）大鼠主動(dòng)脈過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-δ（peroxisomeproliferator-activatedreceptorsδ，PPAR-δ）、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（vascularcelladhesionmolecular-1，VCAM-1）表達(dá)水平的影響。方法：通過(guò)喂養(yǎng)高脂飼料造成動(dòng)脈粥樣硬化的大鼠模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常對(duì)照組，AS模型組和柚皮苷AS組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定血中甘油三脂、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及極低密度脂蛋白的水平，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈PPAR-δ、VCAM-1的基因表達(dá)。結(jié)果：柚皮苷AS組血中甘油三脂、總膽固醇、低密度脂蛋白及極低密度脂蛋白的水平比AS模型組明顯降低，高密度脂蛋白水平明顯升高（P<0.01）；柚皮苷AS組主動(dòng)脈PPAR-δ的基因表達(dá)高于模型組，而VCAM-1的基因表達(dá)則低于模型組（P<0.05）；結(jié)論：柚皮苷可降低AS大鼠的血脂水平，上調(diào)主動(dòng)脈PPAR-δ的基因表達(dá)，下調(diào)VCAM-1的基因表達(dá)，可能為其抗AS的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】柚皮苷；動(dòng)脈粥樣硬化；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-δ；內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1

AS是目前心血管疾病主要的死亡原因，發(fā)病機(jī)制主要為損傷-反應(yīng)學(xué)說(shuō)。在長(zhǎng)期高脂血癥情況下，增高的脂蛋白對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜產(chǎn)生功能性的損傷，使得單核細(xì)胞黏附、遷移、吞噬，最終形成脂質(zhì)條紋[1]。因此脂蛋白的代謝、細(xì)胞的黏附是其中兩個(gè)重要的環(huán)節(jié)。

PPAR-δ作為過(guò)氧化物酶增殖體激活受體（PPAR），是一類基因轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族[2]。現(xiàn)階段認(rèn)為，PPAR-δ在脂肪代謝，改善胰島素抵抗和抗血管炎癥反應(yīng)中起著重要作用[3]。

VCAM-1是免疫球蛋白超基因家族，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，在高血脂刺激AS形成過(guò)程中，能促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，使單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮[4]。

柚皮苷是一種雙氫黃酮類化合物，在某些傳統(tǒng)中藥及水果中含量豐富，如枳實(shí)，骨碎補(bǔ)，柚、橘類果皮及汁等中。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷具有非常廣泛的藥理作用，主要表現(xiàn)為抗炎、抗氧化及抗動(dòng)脈粥樣硬化[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)擬在觀察柚皮苷對(duì)AS大鼠主動(dòng)脈PPAR-δ、VCAM-1基因表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1藥品與試劑柚皮苷由陜西慧科植物開發(fā)有限公司提供、膽酸淮北市創(chuàng)凱生化原料廠提供、膽固醇成都科龍化工試劑廠提供、丙基硫氧嘧啶蘇州恒益醫(yī)藥原料有限公司提供、豬油來(lái)自市售板油煉制、羧甲基纖維素（CMC）上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站提供、Trizol溶液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒由大連寶生物有限公司提供、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇測(cè)定試劑盒由浙江東甌生物工程有限公司提供。

1.2檢測(cè)儀器日立7170S全自動(dòng)生化分析儀，ABIPRISM7000熱循環(huán)儀。

1.3動(dòng)物SPFSD雄性大鼠共40只，體重（220±20）g[四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)（SCXK川2006-14）]。實(shí)驗(yàn)由川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組給藥動(dòng)脈粥樣硬化飼料配方，脂肪乳劑：豬油20%，膽固醇10%，膽酸鈉2%，丙基硫氧嘧啶1%，吐溫-8020%，丙二醇30%加水至100%。動(dòng)物分為3組，一組給普通飼料，另兩組給予AS飼料，共12周，后改喂普通飼料。然后分別灌胃給藥，普通飼料組及AS對(duì)照組（為0.5%CMC溶劑對(duì)照）、柚皮苷AS組（柚皮苷10mg/100g），給藥容量為1ml/100g體重，每天1次，連續(xù)8周，藥物均以0.5%CMC配制。

1.4.2主動(dòng)脈留取實(shí)驗(yàn)結(jié)束后乙醚麻醉動(dòng)物，剖開胸腹腔，腹主動(dòng)脈取血，離心（3500rpm）5min取血清備用。取全主動(dòng)脈，剝離外膜脂肪組織，用于提取RNA。

1.4.3逆轉(zhuǎn)錄PCR將大鼠主動(dòng)脈標(biāo)本研磨勻漿后，移入EP管，采用氯仿-酚法抽提RNA。隨后RNA變性，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.4熒光定量PCR檢測(cè)引物由英俊公司合成。PPAR-δ引物序列，上游引物：5-GTTCGCCAAGGTGCTCCAG-3；下游引物：5-GCTCATATCTGTCTCCGTCTTCTT-3。VCAM-1引物序列，上游引物：5-GGAGACACTGTAATTATCTCCTG-3；下游引物：5-TCCTTTCATGTTGGCTTTTCTTGC-3。GAPDH引物序列，上游引物：5-CTCCCATTCCTCCACCTTG-3。下游引物：5-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3。取1μlcDNA為模板，上游引物和下游引物各0.2μl，反應(yīng)體系為10μl。采用兩步法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行熒光檢測(cè)。目的基因表達(dá)量的相對(duì)水平，△△CT=△CT（test）-△CT（calibrator），其中△CT（test）=CT（target，test）-CT（ref，test）；△CT（calibrator）=CT（target，calibrator）-CT（ref，calibrator）。

1.4.5血清脂質(zhì)指標(biāo)測(cè)定采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清甘油三脂（triglyceride，TG）、總膽固醇（totalcholesterol，TC）、高密度脂蛋白（highdensitylipoproteincholesterol，HDL）、低密度脂蛋白（lowdensitylipoprotein-cholesterol，LDL）及極低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein-cholesterol，VLDL）的水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間顯著性檢驗(yàn)采用ANOVA，兩組之間的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果采用independentt-test，方差齊性檢驗(yàn)采用LevenesTest。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1血脂結(jié)果AS對(duì)照組與常規(guī)飼料組比較，血脂指標(biāo)均顯著升高（表1）。

2.2柚皮苷對(duì)血脂的影響血脂水平比較：與AS對(duì)照組相比，柚皮苷AS組TG、TC、VLDL水平明顯降低，HDL水平明顯增高（P<0.01）（表2）。

2.3熒光定量結(jié)果熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與AS對(duì)照組比較，柚皮苷AS組主動(dòng)脈PPAR-δmRNA表達(dá)增高，VCAM-1mRNA表達(dá)降低（P<0.05）（表3）。

3討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與AS對(duì)照組相比，給予柚皮苷的AS組大鼠血中TC、TG、VLDL水平明顯降低，HDL水平增高。柚皮苷具有廣泛的生物活性。在脂代謝方面，在給予柚皮苷6個(gè)星期后，動(dòng)物可表現(xiàn)為肝臟膽固醇合成降低，HDL-C/TC比例升高，HDL-C無(wú)變化，動(dòng)脈硬化指數(shù)降低[7]。研究證實(shí)，柚皮苷能降低2型糖尿病小鼠肝臟中脂肪酸合酶和葡糖糖-6-磷酸脫氫酶的水平[8]。這些可能與下調(diào)脂酰輔酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，增加糞便甾醇類物質(zhì)排出等有關(guān)[7]。

實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)大鼠主動(dòng)脈PPAR-δ、VCAM-1mRNA的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)與AS對(duì)照組相比，給藥組大鼠主動(dòng)脈PPAR-δ的基因表達(dá)增加，而VCAM-1的基因表達(dá)下降。在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中報(bào)道柚皮苷可能通過(guò)PPAR-γ抑制脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)給予柚皮苷或柚皮素后，2型糖尿病小鼠的脂肪細(xì)胞、肝臟和腎臟組織中PPAR-γ的表達(dá)上調(diào)[8，10]。給予選擇性PPAR-δ激動(dòng)劑GW501516以后，罹患代謝綜合征的印度恒河猴血中TC、HDL的濃度增加，TG和胰島素的水平降低[11]。

柚皮苷對(duì)VCAM-1的作用報(bào)道不一。在LeeCH等對(duì)高脂模型家兔的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可降低胸主動(dòng)脈VCAM-1和單核細(xì)胞化學(xué)趨化蛋白-1的表達(dá)[12]。Jeong等[13]研究發(fā)現(xiàn)，毛地黃黃酮等黃酮類物質(zhì)可抑制ox-LDL活化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VCAM-1和E-選擇素。而KimSW等在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，事先給予柚皮苷刺激后細(xì)胞間黏附分子水平增加，但VCAM-1和E-選擇素?zé)o明顯變化[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前兩者一致。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)柚皮苷可降低AS大鼠的血脂水平，上調(diào)主動(dòng)脈PPAR-δ的基因表達(dá)，下調(diào)VCAM-1的基因表達(dá)，可能通過(guò)影響脂蛋白代謝和細(xì)胞黏附達(dá)到抗AS的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]JellingerPS，SmithDA，MehtaAE，etal.Americanassociationofclinicalendocrinologistsguidelinesformanagementofdyslipidemiaandpreventionofatherosclerosis：Executivesummary[J].EndocrPract，2012，18：269-293.

[2] Filip-CiubotaruF，ManciucC，GrigoreC，etal.[ppars：Physiologicalfunctionsandpharmacologicalrolesofagonistsinhumandiseases.Noteii][J].RevMedChirSocMedNatIasi，2012，116：240-247.

[3] OoiEM，WattsGF，SprecherDL，etal.Mechanismofactionofaperoxisomeproliferator-activatedreceptor（ppar）-deltaagonistonlipoproteinmetabolismindyslipidemicsubjectswithcentralobesity[J].JClinEndocrinolMetab，2011，96：E1568-1576.

[4] MestasJ，LeyK.Monocyte-endothelialcellinteractionsinthedevelopmentofatherosclerosis[J].TrendsCardiovascMed，2008，18：228-232.

[5] PuP，GaoDM，MohamedS，etal.Naringinamelioratesmetabolicsyndromebyactivatingamp-activatedproteinkinaseinmicefedahigh-fatdiet[J].ArchBiochemBiophys，2012，518：61-70.

[6] BodasR，PrietoN，JordanMJ，etal.Theliverantioxidantstatusoffatteninglambsisimprovedbynaringindietarysupplementationat0.15%ratesbutnotmeatquality[J].Animal，2012，6：863-870.

[7] XuluS，OromaOwiraPM.Naringinamelioratesatherogenicdyslipidemiabutnothyperglycemiainratswithtype1diabetes[J].JCardiovascPharmacol，2012，59：133-141.

[8] JungUJ，LeeMK，ParkYB，etal.Effectofcitrusflavonoidsonlipidmetabolismandglucose-regulatingenzymemrnalevelsintype-2diabeticmice[J].IntJBiochemCellBiol，2006，38：1134-1145.

[9] MorikawaK，NonakaM，MochizukiH，etal.Naringeninandhesperetininducegrowtharrest，apoptosis，andcytoplasmicfatdepositinhumanpreadipocytes[J].JAgricFoodChem，2008，56：11030-11037.

[10]SharmaAK，BhartiS，OjhaS，etal.Up-regulationofppargamma，heatshockprotein-27and-72bynaringinattenuatesinsulinresistance，beta-celldysfunction，hepaticsteatosisandkidneydamageinaratmodeloftype2diabetes[J].BrJNutr，2011，106：1713-1723.

[11]OliverWR，Jr.，ShenkJL，SnaithMR，etal.Aselectiveperoxisomeproliferator-activatedreceptordeltaagonistpromotesreversecholesteroltransport[J].ProcNatlAcadSciUSA，2001，98：5306-5311.

[12]JeonSM，ParkYB，ChoiMS.Antihypercholesterolemicpropertyofnaringinaltersplasmaandtissuelipids，cholesterol-regulatingenzymes，fecalsterolandtissuemorphologyinrabbits[J].ClinNutr，2004，23：1025-1034.

[13]JeongYJ，ChoiYJ，ChoiJS，etal.Attenuationofmonocyteadhesionandoxidisedldluptakeinluteolin-treatedhumanendothelialcellsexposedtooxidisedldl[J].BrJNutr，2007，97：447-457.

[14]KimSW，KimCE，KimMH.Flavonoidsinhibithighglucose-inducedup-regulationoficam-1viathep38mapkpathwayinhumanveinendothelialcells[J].BiochemBiophysResCommun，2011，415：602-607.

（收稿日期：2012-11-06）（本文編輯：車艷）