Aβ25～35海馬注射對大鼠海馬硫化氫/胱硫醚β－合酶體系的影響

陳 濤 賈 佳 周發明 周少華※

阿爾茨海默病(AD)是臨床上常見的神經變性疾病，以腦實質細胞外基質中β淀粉蛋白(Aβ)沉積物積聚和腦內大量神經原纖維纏結為主要特征。Aβ具有神經毒性，可以引起神經元細胞凋亡及死亡，出現神經退行性變性臨床癥狀。H2S是一種新發現的氣體信號分子，有重要的生理功能，其中可能參與了AD發病機制中炎癥、細胞凋亡、氧化性損傷等多種病理過程［1，2］。有研究顯示外源性給予H2S可以對抗Aβ的細胞毒性，但Aβ對內源性H2S的影響卻未見報道［3］。本研究希望通過測定大鼠海馬組織中硫化氫含量、CBS的活性，探討進Aβ海馬注射對大鼠腦內源性硫化氫產生的影響，為AD的病理生理機制研究提供理論依據。

1.材料與方法

1.1 實驗分組與模型制備

1.1.1 分組:成年 SD雄性大鼠 24只(體重250～300g)，購自湖北醫藥學院實驗動物中心。經Morris水迷宮(購自中國醫學科學院)測試判定其空間辨別性學習記憶能力，剔除反應過于遲鈍或特別敏感的大鼠，將選出的大鼠隨機分為生理鹽水(NS)組和AD組，后者分Aβ25～35注射2周組AD(2W)、4周組AD(4W)，每組各8只。

1.1.2 模型制備與給藥:AD組雙側海馬區注射點(AP–3.5mm，ML ±2.0mm，DV2.7mm)分別注射 5μl(10μg)Aβ25～35，NS組則注射等量的生理鹽水。術后給予青霉素鈉2萬單位肌注防治感染。

1.2 標本制作與保存 在時間點麻醉大鼠，斷頭取腦后在冰面上迅速分離大鼠雙側海馬，冰生理鹽水中漂洗后用濾紙吸干，置入0.5m l trizol的EP管中保存在－80℃冰箱備用。

1.3 海馬H2S含量的測定 參照采用文獻［4］所述的方法。取0.1m l海馬組織勻漿，加入0.5ml 1%的乙酸鋅，然后分別加入0.5ml 20mmol/LN，N－二甲基對苯二胺鹽酸鹽和0.5ml30mmol/L的三氯化鐵(FeCl3)，室溫靜置10分鐘后，再加入0.5ml10%三氯乙酸(Cl3-C-COOH)及2.5ml蒸餾水，混勻后，4000r/min，離心10分鐘。取上清，利用分光光度計在670nm處，讀取光密度值。根據硫氫化鈉標準曲線，計算各個樣本中H2S濃度。

1.4 海馬中CBS酶活性的測定 參照文獻［5］取海馬勻漿1ml與100mmol/L pH 7.4的磷酸鉀緩沖液、10nmol/L L－半胱氨酸、2mmol/L 5－磷酸吡哆醛加入25ml錐形瓶中進行反應。在中央室中加入1% 的0.5ml醋酸鋅，放入濾紙增加吸收面積。用氮氣將錐形瓶充盈30秒后石蠟膜封口，轉移到37℃水浴搖床中開始反應，90分鐘后向其中注入0.5ml的50%Cl3-C-COOH中止反應，繼續水浴60分鐘后向中央室內加入50μl的N，N－二甲基對苯二胺鹽酸鹽(20mmol/L)/氯化氫(HCl 7.2mol/L)緩沖液及50μl FeCl3(30mmol/L)/氯化氫(HCl1.2mol/L)緩沖液。充分混勻。20分鐘后，用全自動酶標儀在波長670nm測定吸光度，根據H2S標準曲線計算溶液中H2S濃度，組織中CBS活性以單位重量的腦組織在單位時間內生成H2S的量【nmol/(g·h)/】表示。

2.結果

如表1所示。AD(2W)和AD(4W)組同NS組比較，海馬H2 S濃度明顯降低(P＜0.01)，而AD(2W)組與AD(4W)組比較，海馬H2 S濃度差異無統計學意義(P＞0.05)。但AD(2W)組和AD(4W)組同NS組比較，海馬CBS活性卻顯著增強(P＜0.05)，AD(2W)組與AD(4W)組比較，海馬H2 S濃度差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 三組大鼠海馬H2 S含量及CBS活性(±s)

表1 三組大鼠海馬H2 S含量及CBS活性(±s)

注:＊P ＜0.01 vs NS，#P ＞0.05 vs AD(2W)。

項目 N NS組 AD(2W)組 AD(4W)組H2 S(nmol/g) 8 38.67±4.23 21.39±3.82* 18.31±3.46*#CBS【nmol/(g·h)/】 8 45.32 ±6.23 54.13 ±6.71* 59.29 ±7.25*#

3.討論

隨著人口老齡化，AD給社會帶來了沉重的壓力，已經引起了全世界的關注。AD患者的腦神經元周圍可以看到大量的Aβ沉積，Aβ25～35是Aβ片段中的主要毒性成分，可以引起氧化應激和神經元凋亡，同時在Aβ免疫反應沉積處也存在著大量營養不良性軸突，Aβ沉積可能是導致神經元變性和突觸丟失的重要原因［6～8］，以上可能是引起AD的重要病理機制。研究顯示，硫化氫(H2S)廣泛存在于哺乳動物的多種組織器官中，具有多種生理功能，并且與NO、CO這兩種氣體分子在部分生物學功能方面相同或相似，參與許多神經系統疾病的病理生理過程。

通過采用對各組大鼠海馬組織H2S進行測定，我們觀察到，發現AD 2周和4周組與NS組比較，血漿及海馬組織H2S含量均明顯降低，提示Aβ25～35注射可引起大鼠體內H2S水平顯著降低，這一作用在2周就較明顯，至少持續4周。氧化應激是Aβ沉積參與AD的重要機制。而H2S可以清除過氧亞硝酸鹽，提升細胞內谷胱甘肽的濃度以及激活ATP依賴性的K+和Cl－通道發揮抗氧化損傷作用［9］。同時，H2S是一種還原劑，容易與H2O2反應，因此H2S可直接清除ROS，從而發揮神經保護作用［10，11］。此外，內源性H2S作為一種神經遞質，可以通過升高神經細胞內環磷酸腺苷水平，增強腦N－甲基－D－天門冬氨酸(NMDA)受體調節的反應，增加NMDA受體介導的突觸后興奮性電位，從而誘導CA1區海馬長時程增強(LTP)的產生［12］。內源性H2S減少，可使其誘導產生的LTP減少，這可能是引起AD認知功能障礙的一個重要機制。

本實驗還發現，AD 2周和4周組與NS組比較，但海馬CBS表達顯著增加，提示在AD大鼠模型中內源性H2S與CBS之間可能存在負反饋調節作用。而H2S還對CSE和CBS具有負反饋調節作用已在近期的研究中證實［13，14］。具體的機制值得進一步研究。

綜上可知，內源性H2S與CBS可能參與了Aβ25～35誘導的AD發生與發展過程。我們相信隨著深入研究H2S與CBS體系在AD的作用，將會給AD的防治帶來新的思路。

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