普通環境下使用生物安全籠盒BSC系統進行SPF級小鼠的繁殖研究

隋世燕，宋艷秋，蔣 梅，顧志明，唐金珍

（1.大理學院實驗動物中心，云南大理 671000；2.大理學院公共衛生學院，云南大理 671000；3.大理學院臨床醫學院，云南大理 671000；4.蘇杭科技器材有限公司，江蘇蘇州 215001）

普通環境下飼養繁殖的動物，容易受病原微生物和寄生蟲的侵害，影響實驗結果的準確性和可重復性。在屏障系統內繁育無特定病原體（Specific Pathogen-free，SPF）級大小鼠投資大，建設周期長，運行費用高，一些單位無力建設和使用。而具有微型屏障系統功能的獨立通氣籠盒（Individually Ventilated Cages，IVC）雖具有節能環保、操作方便的功能〔1〕，但IVC在普通環境內使用需要搬運到超凈工作臺內給水、給料、換墊料等操作，噴酸消毒作業對動物影響大，稍有操作不規范易將籠內動物污染。而生物安全籠盒（Biological Safety Cage，BSC）是將IVC籠盒飼養在一個負壓凈化環境和生物安全柜內，解決了以上存在的難題。

BSC系統由負壓凈化實驗臺、獨立通氣籠盒IVC籠架（小鼠3層×6=18籠）、IVC籠盒、電器控制系統及監視系統組成。主要應用于生命科學和生物醫藥研究，在普通環境內依照嚴格的實驗室操作規范操作即可飼養SPF大小鼠開展低危感染性動物實驗，一機二用。實驗人員無須穿戴多層防護服，實驗過程舒適。具有節能環保、保護實驗人員的健康與安全，防止人畜共患疾病的發生，防止動物之間交叉感染，保證動物實驗結果的準確性等優點〔2-7〕。

本課題探討在普通環境下使用BSC系統繁育SPF級小鼠的可行性，摸索其操作規程，為BSC系統的普及提供參考數據。

1 材料及方法

1.1實驗材料

1.1.1 器材與試劑 BSC系統（蘇州蘇杭科技器材有限公司，BSCM18）、高壓消毒鍋（山東淄博新華壓力容器廠）、酶標儀（普朗醫療，型號：9602A）、加濕器（杭州正島電器設備有限公司，ZS-40Z型）、抗弓形蟲抗體檢測試劑盒（福建三明藍波生物技術研究所，批號：04070111）、2%過氧乙酸（西安潔立達精細化工有限公司，批號：20090510）、空調、溫度計、無菌衣、一次性口罩、手套和帽子等。

1.1.2 實驗動物 SPF級小鼠，18～21 g，共60只，雄鼠15只，雌鼠45只，購自第三軍醫大學，生產許可證號：SCXK（渝）2007－017，購入后在BSC系統中進行飼養。

1.2實驗方法

1.2.1 飼料、墊料、飲水的消毒 飼料、墊料用包裝袋包裝，飲水為自來水，用水瓶分裝，包裝布包裝，經121℃高壓蒸氣滅菌30 min。

1.2.2 BSC系統飼育小鼠 購入小鼠使用SPF級包裝，小鼠到達前24 h，BSC系統房間全面使用2%過氧乙酸噴霧消毒，前12 h，打開室內紫外線燈，小鼠到達后，鼠盒全面噴霧消毒，BSC系統提前30 min打開紫外線燈，然后在超凈工作臺上打開小鼠包裝箱，BSC籠盒用15%過氧乙酸全面擦拭表面，將小鼠轉入，添加墊料、飲水和飼料，用酒精棉球擦拭通氣孔，將籠盒放回到籠架上。

1.2.3 BSC系統中小鼠的飼養管理及配種 空調控制溫度在22±2℃，加濕器控制相對濕度在50±5%；操作前一天室內紫外線消毒，每隔3～5 d更換墊料、飲水、籠盒和飼料，超凈工作臺提前30 min打開紫外線燈，工作人員戴無菌手套，穿無菌消毒服后開始工作。一位工作人員用2%過氧乙酸擦試消毒籠具外表放在超凈工作臺上，另一名人員打開籠盒，換墊料和飼料，再蓋好蓋子，更換飲水，第一位人員用酒精棉球擦拭通氣孔后將籠盒放入。將引進的SPF級小鼠60只飼養在BSC系統籠盒內，每盒3～5只。飼養2個月后挑出一部分小鼠按雌雄2∶1進行配種，記錄分娩時間。

1.2.4 質量檢測 將引進的60只SPF級小鼠分別在飼養1個月、2個月、3個月時隨機選5只進行質量檢測；子1代小鼠1月齡、2月齡、3月齡時，分別隨機選取5只，依照GB14922.2－2001（SPF級標準）要求的項目進行質量檢測。

體外寄生蟲檢測方法參照GB/T18448.1－2001；弓形蟲檢測使用抗弓形蟲病抗體檢測試劑盒；蠕蟲檢測方法參照GB/T18448.6－2001；鞭毛蟲和纖毛蟲檢測方法參照GB/T18448.10-2001。

沙門菌檢測方法參照GB/T14926.1－2001；支原體檢測使用小鼠支原體ELISA試劑盒；鼠棒狀桿菌檢測使用小鼠棒狀桿菌ELISA試劑盒；泰澤病原體檢測使用小鼠泰澤病原體ELISA試劑盒；嗜肺巴斯德桿菌的檢測方法參照GB/T14926.12-2001；肺炎克雷伯桿菌的檢測方法參照GB/T14926.13-2001；金黃色葡萄球菌的檢測方法參照GB/T14926.14-2001；綠膿桿菌的檢測方法參照GB/T14926.17-2001。

鼠痘病毒檢測使用小鼠鼠痘病毒ELISA試劑盒（廈門慧嘉生物科技有限公司）；小鼠肝炎病毒檢測使用小鼠肝炎病毒ELISA試劑盒（北京富眾科技發展有限公司）；仙臺病毒檢測使用小鼠仙臺病毒ELISA試劑盒（上海寶特生命科學發展有限公司）；小鼠肺炎病毒使用小鼠肺炎病毒ELISA試劑盒（上海勁馬生物科技有限公司）；呼腸孤病毒Ⅲ型使用小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型ELISA試劑盒（上海豐翔生物科技有限公司）；小鼠細小病毒使用小鼠細小病毒ELISA試劑盒（北京鴻躍創新科技有限公司）。

1.3結果統計所有數據均用SPSS17.0軟件進行分析，計算平均值與標準誤。

2 結果

2.1飼料、墊料、飲水消毒情況高壓蒸汽消毒鍋內消毒效果檢測卡顯示消毒物品達到無菌狀態。

2.2小鼠妊娠期小鼠妊娠期，見表1。由表1可知，BSC系統飼養小鼠的妊娠期為18.67±0.07 d，約為18.5 d，與普通環境下使用IVC繁育清潔級小鼠的妊娠期接近。

表1 小鼠妊娠期

2.3小鼠的初生重、離乳重、窩仔數和離乳率小鼠的初生重、離乳重、窩仔數及離乳率，見表2。由表2知，BSC系統飼養小鼠的初生重約為2 g，21 d離乳重14 g左右；BSC系統飼養母鼠的窩產仔數平均約為11只，離乳率達98.5%。

表2 小鼠初生重、離乳重、平均窩產仔數及離乳率

2.4質量檢測共隨機選出30只小鼠進行質量檢測，檢測的內容包括細菌、病毒和寄生蟲，具體項目為沙門菌、支原體、鼠棒狀桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、泰澤病原體、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒、仙臺病毒、小鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒Ⅲ型、小鼠細小病毒、體外寄生蟲、弓形蟲、全部蠕蟲、鞭毛蟲和纖毛蟲。結果全為陰性，說明本實驗飼養的小鼠達到了SPF級水平。

3 討論與分析

BSC系統飼養的小鼠產仔數、離乳率、初生重及離乳重均超過或接近正常屏障系統飼養的小鼠，小鼠質量檢測結果全為陰性，說明在普通環境中嚴格控制條件的情況下，使用BSC系統繁育SPF級小鼠是完全可行的，它避免了普通環境下單獨使用IVC時籠盒搬運到超凈工作臺時的動物污染，使生產的小鼠能夠達到SPF級的要求。

如果BSC籠盒內放的小鼠過多，將使更換籠盒的間隔時間變短，而頻繁更換籠盒容易被病原微生物污染；如果過長時間更換籠盒，其內衛生較差，也容易滋生細菌。通過實驗發現，籠盒在3～5 d需更換一次飲水、墊料和飼料，且每個籠盒適宜飼養3～5只小鼠。

BSC系統將獨立通氣籠IVC和生物安全柜有機地結合在一起，在一個負壓凈化實驗臺內放置多個獨立通氣籠盒來飼養SPF大（小）鼠。由于采用單風機（送風機）負壓凈化技術同時提供實驗區及籠盒內潔凈空氣，故使用BSC系統能確保飼養動物達到SPF級要求。

對于規模較小和使用動物頻率不高的實驗單位，可建立設有BSC系統的動物實驗室，這樣既能保證研究數據的可靠性，又能節約能源和財力。

〔1〕張海峰，盧勝明，康峰，等.獨立通風籠盒（IVC）在動物實驗中的應用〔J〕.實驗動物科學，2011，28（6）：54-56.

〔2〕秦川.醫學實驗動物學〔M〕.北京：人民衛生出版社，2008.

〔3〕任萍萍，程津津，史曉萍.屏障系統實驗動物環境設施建設及運行維護模式〔J〕.實驗動物科學，2011，28（6）：57-58.

〔4〕柯賢福，周莎桑，樓琦，等.實驗動物屏障系統微生物動態狀況〔J〕.中國比較醫學雜志，2010，20（3）：47-50.

〔5〕隋世燕，王林剛，賴仲輝，等.小鼠剖腹產凈化方法研究〔J〕.大理學院學報，2010，9（10）：46-49.

〔6〕張洪，鮑波.淺談國內BALB/c小鼠及KM小鼠的基本生物學特性〔J〕.中國實用醫藥，2010，5（3）：252-254.

〔7〕林瑋，謝金東，劉德強，等.2種不同來源的飼料對小鼠生長和繁殖性能的影響〔J〕.福建中醫學院學報，2010，20（4）：38-39.