耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染監(jiān)測及同源性分析

吳曉紅，王 震，施 瑜，曹珍娣，印夏薇

（鎮(zhèn)江市第二人民醫(yī)院檢驗科1、感染管理科2，江蘇 鎮(zhèn)江 212002）

近年來,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)引起的感染日趨嚴(yán)重。MRSA呈多重耐藥表型[1-2]，因此，對MRSA的臨床分布情況和耐藥性進行監(jiān)測，并尋找導(dǎo)致MRSA院內(nèi)感染的途徑，對控制MRSA院內(nèi)感染，規(guī)范合理地使用抗生素有重要的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2005年2月至2010年3月從我院臨床標(biāo)本中（包括痰、咽拭子、尿液、血液、胸水、腹水、膽汁、傷口分泌物、膿液、靜脈導(dǎo)管等）分離出的金黃色葡萄球菌85株，去除同一患者重復(fù)分離菌株；從醫(yī)護人員手、床單、床頭柜和醫(yī)療器械等院感監(jiān)測標(biāo)本中分離出的金黃色葡萄球菌32株，共計117株。

1.2 方法 當(dāng)臨床實驗室檢測出MRSA菌株后，即刻通知院感人員到病房做多點采樣。細(xì)菌的分離培養(yǎng)及鑒定按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版操作。藥敏試驗采用K-B法進行，結(jié)果的判讀按美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）2008年標(biāo)準(zhǔn)進行，用WHONET 5.3軟件分析。

1.3 MRSA的檢測 M-H瓊脂中加入2%Na-Cl，121℃20 min高壓滅菌后，在9 cm平皿中澆25 ml瓊脂，制成4 mm厚培養(yǎng)基，貼30 μg/片的頭孢西丁（FOX）紙片，35℃，24 h。抑菌圈直徑≤19 mm判為MRSA。質(zhì)控菌株：金葡菌ATCC 25923，由浙江杭州天和微生物試劑公司提供。MRSA陽性對照菌株（JS0405）由江蘇省臨床檢驗中心程梅老師提供。確診方法采用多重PCR方法，以nuc基因和mecA基因合成兩對引物，在279 bp和310 bp處出現(xiàn)擴增條帶表示MRSA。具體方法見文獻[3]。

1.4 重復(fù)一致序列(ERIC)-PCR 選擇腸道菌廣泛存在菌體DNA中的重復(fù)序列ERIC-2(5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3')作 為 引 物[4]。ERIC-PCR 擴增體系：10×Buffer 2.5 μl、MgCl2(2.5 mmol/L)2.5 μl、dNTP(0.2 mmol/L)2.0 μ l、Taq Polymerase 2 U、引物各25 pmol、模板DNA(煮沸法制備)3 μl，添加滅菌去離子水至 25 μl；擴增條件：預(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火35℃ 1 min，延伸72℃2 min，48個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后，溴乙啶染色，在紫外線下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組耐藥率的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SA、MRSA臨床分布情況 共檢出SA 117株，其中臨床標(biāo)本中檢出SA 85株，院感標(biāo)本中檢出SA 32株。MRSA檢出率為63.2%(74/117)。MRSA感染以呼吸科、泌尿外科、普外科的患者居多。MRSA在痰液樣本中分離率最高(25.7%)，其次是傷口分泌物、膿液(17.6%)和尿液標(biāo)本(14.9%)。各類院感標(biāo)本中MRSA都有不同程度檢出，以醫(yī)護人員手、物體表面(床單、床頭桂、把手)、醫(yī)療器械等為主，見表1。

表1 SA、MRSA在臨床標(biāo)本及院感監(jiān)測標(biāo)本中的分布

2.2 MSSA、MRSA對16種抗生素的耐藥性比較 MRSA對常用抗菌藥物有較高的耐藥率，如氨芐西林(100%)、紅霉素(83.8%)、阿奇霉素(82.4%)、諾氟沙星(82.4%)、環(huán)丙沙星(68.9%)、克林霉素(68.9%)、丁胺卡那(64.9%)、四環(huán)素(60.8%)、氯霉素(55.4%)、氧氟沙星(51.4%)、復(fù)方新諾明(39.2%)、米諾環(huán)素(25.7%)、利福平(13.5%)、莫匹羅星(2.7%)，萬古霉素、替考拉寧的敏感性為100.0%。MRSA的耐藥率高于MSSA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 MSSA、MRSA對16種抗生素的耐藥率

2.3 ERIC-PCR分型 74株MRSA均能擴增出清晰的DNA指紋圖譜，擴增出的條帶為3～9條，大小為200～1500 bp。根據(jù)擴增片段數(shù)目、大小不同，將74株MRSA分成8個型，圖1中條帶1、2分別來源于泌尿外科住院患者尿液標(biāo)本和膀胱造瘺管排尿口；條帶3、4分別來源于普外科住院患者傷口膿液標(biāo)本和床單；條帶5、6、7分別來源于呼吸內(nèi)科不同住院患者的痰液和呼吸機管道。結(jié)果表明同型菌株多來源于同一病房。醫(yī)護人員手、床單和醫(yī)療器械等導(dǎo)致的交叉感染，是引起MRSA醫(yī)院內(nèi)傳播的主要原因。

圖1 ERIC-PCR分型結(jié)果

3 討 論

本次研究對金黃色葡萄球菌的臨床分布及耐藥性進行統(tǒng)計分析，并采用多重PCR檢測mecA基因的攜帶情況，比較耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)與甲氧西林敏感葡萄球菌(MSSA)的耐藥率，同時采用腸桿菌科基因間重復(fù)一致序列(ERIC)-PCR方法對MRSA做同源性分析。結(jié)果共檢出SA 117株，其中臨床標(biāo)本中檢出SA 85株，院感標(biāo)本中檢出SA 32株。MRSA檢出率為63.2%(74/117)。MRSA感染以呼吸內(nèi)科、泌尿外科、普外科的患者居多。MRSA在痰液樣本中分離率最高(25.7%)，其次是傷口分泌物、膿液(17.6%)和尿液標(biāo)本(14.9%)。各類院感標(biāo)本中MRSA都有不同程度檢出，以醫(yī)護人員手、物體表面(床單、床頭桂、把手)、醫(yī)療器械等為主。MRSA對常用抗菌藥物有較高的耐藥率，如氨芐西林(100%)、紅霉素(83.8%)、阿奇霉素(82.4%)、諾氟沙星(82.4%)、環(huán)丙沙星(68.9%)、克林霉素(68.9%)、丁胺卡那(64.9%)、四環(huán)素(60.8%)、氯霉素(55.4%)、氧氟沙星(51.4%)、復(fù)方新諾明(39.2%)、米諾環(huán)素(25.7%)、利福平(13.5%)、莫匹羅星(2.7%)，萬古霉素、替考拉寧的敏感性為100.0%。MRSA耐藥率高于MSSA，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。通過ERIC-PCR分型，將74株MRSA分成8個型，結(jié)果表明同型菌株多來源于同一病房。通過本次研究，發(fā)現(xiàn)醫(yī)護人員手、床單和醫(yī)療器械等導(dǎo)致的交叉感染是引起MRSA醫(yī)院內(nèi)傳播的主要原因。可通過以下幾個方面的工作，減少MRSA的院內(nèi)感染率。

MRSA的主要耐藥機制是由染色體介導(dǎo)產(chǎn)生特異性低親和力的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a，mecA基因是PBP2a的編碼基因，是MRSA的主要耐藥因子[5]。MRSA除攜帶mecA基因外，還有多種其他耐藥基因，因此MRSA表現(xiàn)為多重耐藥表型[6]。由MRSA引起的院內(nèi)交叉感染常難以控制[7]。因此，應(yīng)該在抗生素使用前留取標(biāo)本做細(xì)菌學(xué)檢查并對病原菌作藥敏試驗，選擇合適抗生素治療，并盡量選用一、二代抗生素，從而有效避免MRSA產(chǎn)生。

由醫(yī)務(wù)人員及病員家屬的手導(dǎo)致的醫(yī)院感染不容忽視。落實正確的洗手方法并一貫堅持是非常關(guān)鍵的[1]。在接觸患者前、后以及患者的排泄物后都應(yīng)該認(rèn)真徹底的洗手。另外，用快速消毒劑作手部清洗也是一個很好的方法。

與患者接觸的所有設(shè)備及儀器應(yīng)每日消毒，并定期做細(xì)菌學(xué)監(jiān)測。椅、桌面、地面用含氯消毒劑消毒，不同病室的拖把不能混用，被污染的器材和物品應(yīng)消毒后再清洗、滅菌。

實施隔離措施是切斷傳播途徑的有效措施。對已經(jīng)確診為MRSA感染患者應(yīng)在床頭作醒目表識，并要求隔離治療。MRSA感染者使用過的物品要先消毒后再清洗。污染物用黃色垃圾袋盛裝,作焚燒處理。

[1]閻紅霞,殷小基,郭發(fā)良.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌醫(yī)院感染分析與預(yù)防措施[J].臨床醫(yī)學(xué),2006,26(11)：2-3.

[2]劉惠容,林定忠.臨床標(biāo)本耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分布及藥敏分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2011,18(10)：70-71.

[3]吳曉紅,王 震.多重PCR快速檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[J].疑難病雜志,2010,9(11)：851-853.

[4]王 震,周麗萍,莊建偉,等.大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌耐藥基因分析[J].中國公共衛(wèi)生,2008,24(7)：818-820.

[5]羅少峰,彭少華,顧 劍.湖北地區(qū)金黃色葡萄球菌耐藥性變遷[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2007,17(8)：997.

[6]陳 劍,余方有,王彩虹.耐復(fù)方新諾明金黃色葡萄球菌耐藥譜分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2008,18(10)：1482-1484.

[7]樊劍鋒,楊永弘,馬 琳.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗生素耐藥和耐藥基因的檢測[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2005,26(5)：540-544.