耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染監(jiān)測及同源性分析

吳曉紅，王 震，施 瑜，曹珍娣，印夏薇

（鎮(zhèn)江市第二人民醫(yī)院檢驗科1、感染管理科2，江蘇 鎮(zhèn)江 212002）

近年來,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)引起的感染日趨嚴重。MRSA呈多重耐藥表型[1-2]，因此，對MRSA的臨床分布情況和耐藥性進行監(jiān)測，并尋找導致MRSA院內感染的途徑，對控制MRSA院內感染，規(guī)范合理地使用抗生素有重要的指導意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2005年2月至2010年3月從我院臨床標本中（包括痰、咽拭子、尿液、血液、胸水、腹水、膽汁、傷口分泌物、膿液、靜脈導管等）分離出的金黃色葡萄球菌85株，去除同一患者重復分離菌株；從醫(yī)護人員手、床單、床頭柜和醫(yī)療器械等院感監(jiān)測標本中分離出的金黃色葡萄球菌32株，共計117株。

1.2 方法 當臨床實驗室檢測出MRSA菌株后，即刻通知院感人員到病房做多點采樣。細菌的分離培養(yǎng)及鑒定按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第3版操作。藥敏試驗采用K-B法進行，結果的判讀按美國國家臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2008年標準進行，用WHONET 5.3軟件分析。

1.3 MRSA的檢測 M-H瓊脂中加入2%Na-Cl，121℃20 min高壓滅菌后，在9 cm平皿中澆25 ml瓊脂，制成4 mm厚培養(yǎng)基，貼30 μg/片的頭孢西丁（FOX）紙片，35℃，24 h。抑菌圈直徑≤19 mm判為MRSA。質控菌株：金葡菌ATCC 25923，由浙江杭州天和微生物試劑公司提供。MRSA陽性對照菌株（JS0405）由江蘇省臨床檢驗中心程梅老師提供。確診方法采用多重PCR方法，以nuc基因和mecA基因合成兩對引物，在279 bp和310 bp處出現擴增條帶表示MRSA。具體方法見文獻[3]。

1.4 重復一致序列(ERIC)-PCR 選擇腸道菌廣泛存在菌體DNA中的重復序列ERIC-2(5'-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3')作 為 引 物[4]。ERIC-PCR 擴增體系：10×Buffer 2.5 μl、MgCl2(2.5 mmol/L)2.5 μl、dNTP(0.2 mmol/L)2.0 μ l、Taq Polymerase 2 U、引物各25 pmol、模板DNA(煮沸法制備)3 μl，添加滅菌去離子水至 25 μl；擴增條件：預變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火35℃ 1 min，延伸72℃2 min，48個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。產物用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后，溴乙啶染色，在紫外線下觀察。

1.5 統(tǒng)計學處理 用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組耐藥率的比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SA、MRSA臨床分布情況 共檢出SA 117株，其中臨床標本中檢出SA 85株，院感標本中檢出SA 32株。MRSA檢出率為63.2%(74/117)。MRSA感染以呼吸科、泌尿外科、普外科的患者居多。MRSA在痰液樣本中分離率最高(25.7%)，其次是傷口分泌物、膿液(17.6%)和尿液標本(14.9%)。各類院感標本中MRSA都有不同程度檢出，以醫(yī)護人員手、物體表面(床單、床頭桂、把手)、醫(yī)療器械等為主，見表1。

表1 SA、MRSA在臨床標本及院感監(jiān)測標本中的分布

2.2 MSSA、MRSA對16種抗生素的耐藥性比較 MRSA對常用抗菌藥物有較高的耐藥率，如氨芐西林(100%)、紅霉素(83.8%)、阿奇霉素(82.4%)、諾氟沙星(82.4%)、環(huán)丙沙星(68.9%)、克林霉素(68.9%)、丁胺卡那(64.9%)、四環(huán)素(60.8%)、氯霉素(55.4%)、氧氟沙星(51.4%)、復方新諾明(39.2%)、米諾環(huán)素(25.7%)、利福平(13.5%)、莫匹羅星(2.7%)，萬古霉素、替考拉寧的敏感性為100.0%。MRSA的耐藥率高于MSSA，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 MSSA、MRSA對16種抗生素的耐藥率

2.3 ERIC-PCR分型 74株MRSA均能擴增出清晰的DNA指紋圖譜，擴增出的條帶為3～9條，大小為200～1500 bp。根據擴增片段數目、大小不同，將74株MRSA分成8個型，圖1中條帶1、2分別來源于泌尿外科住院患者尿液標本和膀胱造瘺管排尿口；條帶3、4分別來源于普外科住院患者傷口膿液標本和床單；條帶5、6、7分別來源于呼吸內科不同住院患者的痰液和呼吸機管道。結果表明同型菌株多來源于同一病房。醫(yī)護人員手、床單和醫(yī)療器械等導致的交叉感染，是引起MRSA醫(yī)院內傳播的主要原因。

圖1 ERIC-PCR分型結果

3 討 論

本次研究對金黃色葡萄球菌的臨床分布及耐藥性進行統(tǒng)計分析，并采用多重PCR檢測mecA基因的攜帶情況，比較耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)與甲氧西林敏感葡萄球菌(MSSA)的耐藥率，同時采用腸桿菌科基因間重復一致序列(ERIC)-PCR方法對MRSA做同源性分析。結果共檢出SA 117株，其中臨床標本中檢出SA 85株，院感標本中檢出SA 32株。MRSA檢出率為63.2%(74/117)。MRSA感染以呼吸內科、泌尿外科、普外科的患者居多。MRSA在痰液樣本中分離率最高(25.7%)，其次是傷口分泌物、膿液(17.6%)和尿液標本(14.9%)。各類院感標本中MRSA都有不同程度檢出，以醫(yī)護人員手、物體表面(床單、床頭桂、把手)、醫(yī)療器械等為主。MRSA對常用抗菌藥物有較高的耐藥率，如氨芐西林(100%)、紅霉素(83.8%)、阿奇霉素(82.4%)、諾氟沙星(82.4%)、環(huán)丙沙星(68.9%)、克林霉素(68.9%)、丁胺卡那(64.9%)、四環(huán)素(60.8%)、氯霉素(55.4%)、氧氟沙星(51.4%)、復方新諾明(39.2%)、米諾環(huán)素(25.7%)、利福平(13.5%)、莫匹羅星(2.7%)，萬古霉素、替考拉寧的敏感性為100.0%。MRSA耐藥率高于MSSA，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。通過ERIC-PCR分型，將74株MRSA分成8個型，結果表明同型菌株多來源于同一病房。通過本次研究，發(fā)現醫(yī)護人員手、床單和醫(yī)療器械等導致的交叉感染是引起MRSA醫(yī)院內傳播的主要原因。可通過以下幾個方面的工作，減少MRSA的院內感染率。

MRSA的主要耐藥機制是由染色體介導產生特異性低親和力的青霉素結合蛋白PBP2a，mecA基因是PBP2a的編碼基因，是MRSA的主要耐藥因子[5]。MRSA除攜帶mecA基因外，還有多種其他耐藥基因，因此MRSA表現為多重耐藥表型[6]。由MRSA引起的院內交叉感染常難以控制[7]。因此，應該在抗生素使用前留取標本做細菌學檢查并對病原菌作藥敏試驗，選擇合適抗生素治療，并盡量選用一、二代抗生素，從而有效避免MRSA產生。

由醫(yī)務人員及病員家屬的手導致的醫(yī)院感染不容忽視。落實正確的洗手方法并一貫堅持是非常關鍵的[1]。在接觸患者前、后以及患者的排泄物后都應該認真徹底的洗手。另外，用快速消毒劑作手部清洗也是一個很好的方法。

與患者接觸的所有設備及儀器應每日消毒，并定期做細菌學監(jiān)測。椅、桌面、地面用含氯消毒劑消毒，不同病室的拖把不能混用，被污染的器材和物品應消毒后再清洗、滅菌。

實施隔離措施是切斷傳播途徑的有效措施。對已經確診為MRSA感染患者應在床頭作醒目表識，并要求隔離治療。MRSA感染者使用過的物品要先消毒后再清洗。污染物用黃色垃圾袋盛裝,作焚燒處理。

[1]閻紅霞,殷小基,郭發(fā)良.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌醫(yī)院感染分析與預防措施[J].臨床醫(yī)學,2006,26(11)：2-3.

[2]劉惠容,林定忠.臨床標本耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分布及藥敏分析[J].中國當代醫(yī)藥,2011,18(10)：70-71.

[3]吳曉紅,王 震.多重PCR快速檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[J].疑難病雜志,2010,9(11)：851-853.

[4]王 震,周麗萍,莊建偉,等.大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌耐藥基因分析[J].中國公共衛(wèi)生,2008,24(7)：818-820.

[5]羅少峰,彭少華,顧 劍.湖北地區(qū)金黃色葡萄球菌耐藥性變遷[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2007,17(8)：997.

[6]陳 劍,余方有,王彩虹.耐復方新諾明金黃色葡萄球菌耐藥譜分析[J].中華醫(yī)院感染學雜志,2008,18(10)：1482-1484.

[7]樊劍鋒,楊永弘,馬 琳.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗生素耐藥和耐藥基因的檢測[J].首都醫(yī)科大學學報,2005,26(5)：540-544.