頭穴叢刺法對慢性腦缺血大鼠海馬VEGF表達的影響

王春霞,王東巖,王雅青,許娜,徐軍,孫遠征

?

頭穴叢刺法對慢性腦缺血大鼠海馬VEGF表達的影響

王春霞1,王東巖1,王雅青2,許娜2,徐軍2,孫遠征1

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫藥大學,哈爾濱 150040)

觀察頭穴叢刺方法對慢性腦缺血大鼠認知功能和VEGF表達的影響。40只大鼠采用改良的雙側頸總動脈永久性結扎法(2VO)制備慢性腦缺血模型,造模成功的大鼠分為假手術組(A組)、模型組(B組)和頭穴叢刺組(C組)和尼莫地平組(D組)。C組采用頭穴叢刺法,D組行尼莫地平灌胃,A組和B組不予治療。治療結束后采用Morris水迷宮檢測大鼠的認知功能;光鏡下觀察海馬細胞形態變化;免疫組化檢測海馬VEGF蛋白表達。術后8星期B、C、D組逃避潛伏期明顯延長,與A組相比差異具有統計學意義(＜0.05);C組和D組與B組相比,逃避潛伏期縮短(＜0.05)。HE染色C組和D組變性、死亡神經細胞較B組明顯減輕。免疫組化A組偶見VEGF陽性細胞表達,B、C、D組均可見VEGF蛋白表達增高,與A組比較差異具有統計學意義(＜0.05);C組和D組較B組表達升高(＜0.05)。頭穴叢刺能夠明顯改善大鼠的認知功能,其可能通過上調VEGF蛋白表達,從而對慢性腦缺血后新生血管的形成具有促進作用,對神經元恢復具有重要的意義。

頭針;腦缺血;認知功能;海馬;VEGF

慢性腦缺血是各種原因引發的長期慢性腦血流灌注不足導致的以持久或進展性認知功能障礙為主要表現的一組疾病,發病早期以認知功能損害為主要表現,最終導致持久或進展性認知與神經功能障礙[1],是血管性癡呆、Alzheimer病和Binswanger病等多種疾病的共同病理基礎。隨著人口的老齡化,慢性腦缺血發病率越來越高,嚴重影響人們的生活質量。慢性腦缺血與急性腦缺血不同,它有較長的臨床前期可供干預,多年來大量研究者一直致力于腦缺血后認知功能障礙的防治研究,尋找有效的防治方法具有重要的意義。本實驗通過觀察頭穴叢刺對慢性腦缺血損傷大鼠認知功能和海馬VEGF表達的影響,揭示頭穴叢刺治療慢性腦缺血致認知功能障礙的作用機制,為臨床上應用頭穴叢刺法治療慢性腦缺血患者提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

選用健康雄性Wistar大鼠40只(由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供),體重(180±30)g。大鼠適應性飼養1星期,采用Morris水迷宮訓練5 d,剔除游泳能力差的大鼠,隨機分為假手術組(A組)8只和手術組32只,手術組死亡5只。手術后4星期再通過Morris水迷宮試驗檢測大鼠學習記憶能力,造模成功的大鼠分為模型組(B組)、頭穴叢刺組(C組)和尼莫地平組(D組),每組9只。

1.2 模型制備

參照Sarti等[2]改良的雙側頸總動脈永久性結扎法(2VO)制備慢性腦缺血大鼠模型。10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉,保證手術期間有自主呼吸,取頸前部正中切口,鈍性分離暴露左側頸總動脈(CCA)后結扎該側頸總動脈,逐層縫合,1星期后按照上面同樣步驟結扎右側頸總動脈后完成模型制作。假手術組僅分離暴露雙側CCA而不結扎。術后每日肌肉注射青霉素20萬U/kg體重,預防感染,連續4 d。

1.3 治療方法

模型組不予任何治療。頭穴叢刺組于術后第5星期開始針刺治療,參照《實驗動物穴位圖譜》取大鼠的百會和百會左右旁開2 mm三個穴位,大鼠頭頂部常規剪毛消毒,用0.35 mm×25 mm毫針從后向前平刺6～8 mm,留針30 min,每15 min捻針1次,頻率為每分鐘200轉,每次持續捻轉3 min,每日1次,共治療4星期。尼莫地平組于術后第5星期開始灌胃治療,每20 mg尼莫地平溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液100 mL配成0.02%懸浮液,按1 mg/kg灌胃,每日1次,與頭針組同一時段進行,連續治療4星期。

1.4 Morris水迷宮試驗

Morris水迷宮由圓形水池、自動攝像機及電腦分析系統組成。數據的采集及圖像分析均由圖像自動監視和處理系統完成。

水迷宮試驗以搜索持續時間(逃避潛伏期)作為評價指標,大鼠找到平臺所用的時間越長說明其學習記憶能力越差。

1.5 標本的采集

各組大鼠造模后8星期以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射,麻醉生效后仰臥位固定,快速剪開胸腹腔,清晰暴露心臟和主動脈弓,剪開右心耳,速將輸液器針頭自心尖處通過左心室插入主動脈,快速灌注0.9%生理鹽水約200 mL,待液體從右心耳流出變清亮時,換用含4%多聚甲醛的0.1 MPBS(pH7.4)緩沖液200 mL進行灌注固定,斷頭取腦,取以視交叉為中心相當于前聯合連續腦片繼續固定4～6 h。常規梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋,用切片機切成5mm薄片,貼于載玻片上。將做好的石蠟切片放置在56℃烤箱中烘烤2 h,使石蠟切片和載玻片緊密粘附,防止脫片。存放于干燥避光處用于HE染色及免疫組化染色檢測。

1.6 免疫組化染色及結果判定

免疫組化染色采用SP法,兔抗鼠VEGF抗體由武漢博士德公司提供。細胞質、胞漿內粉紅色至棕黃色染色為陽性表達,應用人工計數法計算陽性細胞率,每張切片選取3個400×鏡下視野計數陽性細胞數,以單個標本為單位,取平均值,最后統計陽性細胞占細胞總數的百分比。

1.7 統計學方法

數據用均數±標準差表示,采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析處理,組內均數比較采用配對檢驗,組間比較采用單因素方差分析,方差齊之后采用檢驗進行組間的兩兩比較,＜0.05表示差異有統計學意義。方差不齊者采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 認知功能的檢測

術后8星期模型組、頭穴叢刺組和尼莫地平組大鼠逃避潛伏期明顯延長,與假手術組相比具有顯著性差異(＜0.05),大鼠的認知功能明顯減退;頭穴叢刺組和尼莫地平組與模型組相比,逃避潛伏期明顯縮短(＜0.05),說明大鼠的認知功能有所改善。詳見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較 (±s,s)

注:與假手術組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

2.2 HE染色結果

假手術組未發現明顯病理變化,海馬4至多層錐體細胞排列整齊、緊密,細胞核大而圓,核仁清晰,HE染色均勻,細胞結構完整,輪廓清晰。模型組錐體細胞數量明顯減少,由4至多層減至2層,且層次不清,細胞排列稀疏,神經細胞嚴重變形,核固縮,胞漿消失,染色不均,有空泡形成,核仁顯示不清晰。頭穴叢刺組海馬細胞3至4層,排列層次及細胞形態清晰,胞質染色均勻色淺,少見固縮錐體細胞。尼莫地平組海馬區細胞數目較多,3層左右,層次較清晰,細胞形態尚規則,細胞邊緣清晰,少見固縮椎體細胞。詳見圖1。

圖1 各組大鼠海馬區HE染色

2.3 免疫組化檢測VEGF結果

免疫組化結果顯示,VEGF蛋白陽性表達胞漿呈粉紅色至棕黃色。假手術組神經細胞數量、形態分布正常,VEGF蛋白呈少量表達。模型組、頭穴叢刺組和尼莫地平組可見VEGF表達增高,與假手術組比較差異具有統計學意義(＜0.05),而頭穴叢刺組和尼莫地平組較模型組表達更高(＜0.05)。詳見表2、圖2。

表2 各組大鼠海馬VEGF陽性表達比較 (±s)

注:與假手術組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

圖2 各組大鼠海馬VEGF 蛋白表達(箭頭示VEGF 表達)

3 討論

大量研究表明缺血性腦損傷的病理機制非常復雜,有多個病理生理環節參與,是一個多基因和多靶點參與的過程。孫莉等[3]發現,大鼠雙側頸總動脈結扎后1個月時額、顳葉等皮質及海馬區以錐體細胞缺血改變為主,皮質下白質可見膠質細胞增生。隨后的2～4個月內逐漸轉變為錐體細胞凝固性壞死、變性、脫失,膠質細胞增生及小血管的增生,并且海馬區以CA1區改變最為明顯。張海寧等[4]通過對電鏡下脂褐素和暗神經元改變的研究,認為慢性腦缺血初期腦損傷是可逆的,電鏡下1個月或更早可能是可逆損傷的轉折點。有研究認為結扎后3星期為慢性缺血期。楊宇等[5]在研究中發現,慢性缺氧使實驗組大鼠的空間定位記憶能力受到嚴重損害,對海馬CA1區神經元的形態和結構具有明顯的破壞作用。可見,海馬是腦缺血最為敏感的部位,與認知功能有密切的關系,是學習和記憶的重要部位,因此我們選擇大鼠海馬作為研究對象。

慢性腦缺血發病早期以認知功能損害為主要表現,屬于中醫學“呆病”范疇。腦為髓海,元神之府,神機之源。人的精神、記憶、思維等障礙皆與腦相關,因此,本病病位在腦已形成共識。頭為“諸陽之會”、“清陽之腑”,五臟之精血、六腑之清氣,皆上注于腦,所以治療重點應該針對腦腑,以腦局部取穴為主,使針感直達病所。頭穴叢刺法是針灸專家于致順教授根據中醫經絡理論和現代醫學神經解剖學知識提出來的,以在頭部相應治療區進行“叢式”針刺,并以間斷行針為特點的頭穴針刺方法。這樣的針刺方法從針刺部位上來說,使對頭部的刺激由原來點狀刺激或線狀刺激擴展到了面狀刺激,增加了針刺的刺激面積。從另一角度來講,在施用相同的針刺手法情況下,增加刺激面積,也就是增加了刺激量。這是頭穴叢刺法優于其他頭針療法的一個重要特點。王利春等[6]認為頭穴叢刺能通過增加腦血流量,改善微循環,促進神經細胞的能量代謝,使腦神經細胞機能再恢復,從而增強學習、記憶功能。

一般認為,Ca2＋內流是細胞死亡的最后途徑。尼莫地平脂溶性很高,是慢通道電壓依賴性Ca2＋拮抗劑,對中樞神經有特殊選擇作用,既能減輕Ca2＋超載引起的腦水腫和繼發性損害[7],也可以擴張腦血管增加腦血流量,促進神經功能恢復[8]。有研究表明尼莫地平可減輕大鼠慢性腦缺血造成的自由基損傷和行為學障礙[9],也有臨床試驗證實尼莫地平可改善認知功能[10-11]。故我們選取尼莫地平作為對照藥物。

本研究應用頭穴叢刺法與尼莫地平藥物對照治療慢性腦缺血致認知功能障礙大鼠,并觀察對大鼠認知功能和VEGF表達的影響。結果術后8星期模型組、頭穴叢刺組和尼莫地平組逃避潛伏期明顯延長,與假手術組相比差異顯著(＜0.05),說明術后大鼠出現認知功能障礙,而頭穴叢刺組和尼莫地平組與模型組相比,逃避潛伏期有明顯縮短(＜0.05),說明大鼠認知功能有所改善。免疫組化結果顯示假手術組偶見VEGF陽性細胞表達,模型組、針刺組和藥物組均可見VEGF蛋白表達增高,與假手術組比較差異顯著(＜0.01);針刺組和藥物組較模型組表達更高(＜0.01)。

實驗中,術后8星期,假手術組大鼠海馬區偶見VEGF蛋白表達,模型組大鼠可見VEGF表達明顯增加,表明慢性腦缺血后VEGF蛋白反應性增加,進而促使新生血管形成,而血管形成又是局部組織代謝和功能恢復所必需的,有重要的神經保護作用,這可能是慢性腦缺血大鼠對缺血的一種代償性反應;而且頭穴叢刺組和尼莫地平組大鼠海馬VEGF蛋白表達比模型組更多,這說明頭穴叢刺和尼莫地平均能促進VEGF蛋白的分泌,因而推論其對慢性腦缺血后新生血管的形成有促進作用,對神經元的恢復有重要作用。頭穴叢刺可通過調整顱內外血管舒縮功能,改善局部微循環障礙,促進大腦血液循環,提高腦組織的含氧量,加強腦細胞的營養,改善皮層抑制狀態,促進腦組織的修復,激活受損神經細胞的功能,調動正常腦細胞的潛在功能儲備,從而加強腦功能的代償作用,達到治療疾病的目的,并且長期應用無不良反應。針灸由于其可以通過多系統、多水平、多層次、多途徑、多靶點綜合作用于慢性腦缺血多個病理環節,有從整體上有效改善慢性腦缺血致認知功能障礙的前景。

[1] Horvath S. The pathological and clinical consequences of chronic cerebral hypooperfusion[J]. Orv Hetil, 2001,142(8):383-389.

[2] Sarti C, Pantoni L, Bartolini L,. Cognitive impairment and chronic cerebral hypoperfusion: What can be learned from experimental models[J]. Neurol Sci, 2002,203-204:263-266.

[3] 孫莉,張昱,鄒昕穎,等.慢性前腦缺血致癡呆大鼠皮質及皮質下白質區病理學變化的對比研究[J].中風與神經疾病雜志,2004,21 (5):403-405.

[4] 張海寧,吳江,孫莉,等.慢性前腦缺血致血管性癡呆大鼠神經元超微結構的經時變化[J].中風與神經疾病雜志,2009,26(1):37-40.

[5] 楊宇,譚勝玉,張新民,等.慢性間歇性缺氧對大鼠認知功能及海馬CA1區超微結構的影響[J].中華老年醫學雜志,2007,26(2):145- 146.

[6] 王利春,王志勇,王秀清,等.頭穴叢刺對多梗死性癡呆患者血漿內皮素及降鈣素基因相關肽的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2009, 16(1):18-20.

[7] 楊華堂,劉秀杰,趙軍蒼,等.尼莫地平對腦損傷后腦功能恢復的價值[J].中國臨床康復,2004,8(1):62.

[8] Langham J, Goldfrad C, Teasdeal G,. Calcium channel blockers for acute traumatic brain injury[J]. Cochrane Database Sya Rev, 2003, (4):CD000565.

[9] Yanpallewar SU, Hota D, Rai S,. Nimodipine attenuates bioch- emical behavior and histopathological alterations induced by acute transient and long-term bilateral common carotid occlusion in rats[J]. Pharmacol Res, 2004,49:143-150.

[10] 王煒,王魯寧,張曉紅,等.尼莫地平對輕度認知損傷患者的干預治療研究[J].中華內科雜志,2006,45(4):274-276.

[11] Pantoni L, del Ser T, Soglian AG,. Efficacy and safety of nimodipine in subcortical vascular dementia: a randomized placebo-controlled trial[J]. Stroke, 2005,36(3):619-624.

Effect of Cluster Needling at Scalp Points on Hippocampal VEGF Expression in Rats with Chronic Cerebral Ischemia

-1,-1,-2,2,2,-1.

1.Chinese Medicine Second Hospital,Harbin 150001,China; 2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040,China

To investigate the effect of cluster needling at scalp points on cognitive function and hippocampal VEGF expression in rats with chronic cerebral ischemia.Forty rats were used to make a model of chronic cerebral ischemia by modified permanent bilateral common carotid artery ligation. The rat models were assigned to sham operation group (group A), model group (group B), scalp point cluster needling group (group C) and nimodipine group (group D). Group Creceived cluster needling at scalp points and group D, nimodipine gavage. Groups A and B were not treated. After the end of treatment, rat cognitive function was assessed using a Morris water maze. Hippocampal cell forms were observed by light microscopy. Hippocampal VEGF protein expression was examined by an immunohistochemical method.At 8 weeks after operation, the escape latency lengthened significantly in groups B, C and D; there was a statistically significant difference compared with group A (＜0.05). The escape latency shortened in groups C and D compared with group B (＜0.05). HE staining showed that neuronal degeneration and necrosis abated significantly in groups C and D compared with group B. The immunohistochemical examination showed that VEGF expression-positive cells occasionally appeared in group A. VEGF protein expression increased in groups B, C and D; there was a statistically significant difference compared with group A (＜0.05). The expression increased in groups C and D compared with group B (＜0.05).Cluster needling at scalp points can significantly improve rat cognitive function. It promotes post-chronic cerebral ischemia formation of new blood vessels probably by up-regulation of VEGF protein expression, which is of important significance for neuronal recovery.

Scalp acupuncture; Cerebral ischemia; Cognitive function; Hippocampus; VEGF

1005-0957(2012)08-0609-04

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.08.609

2012-02-20

王春霞(1979 - ),女,主治醫師

孫遠征(1957 - ),男,主任醫師,研究方向為針藥結合防治老年性疾病,E-mail:sunyuanzheng@163.com