銀屑病基因差異化表達研究

楊積順 徐立平

(解放軍第100醫院藥械科，215007)

銀屑病是常見的慢性復發性皮膚病，其發病機制仍不清楚。基因芯片，又稱基因微陣列，是將大量的靶基因DNA片段以及不同長度的寡核苷酸高密度、有序地排列在硅片及合金片等固相物質上。該技術已廣泛應用于基因表達圖譜分析、腫瘤分子分型、基因診斷、基因突變、新藥研發等方面，且具有背景噪音低、重復性好、系統誤差小等優點。銀屑病發病機制中的重要相關基因還有待進一步的明確，因此，本研究采用現代基因芯片技術，通過使用隨機方差模型，篩選出銀屑病病人及健康人皮膚中顯著性差異基因，試為揭示銀屑病發病機制及藥物研究提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 皮膚組織來源 銀屑病病人皮損組織3例，來源于皮膚科門診，年齡(32.25±4.36)歲，部位為病人腹部皮膚；健康人皮膚組織3例，來源于醫院整形科門診，年齡(37.34±4.16)歲，取材部位為腹部皮膚。銀屑病皮膚樣本由病理科組織病理學確認，3例銀屑病病人入組前均未患其他皮膚性疾病，且未進行過局部或系統性藥物治療。所有參加本研究的志愿者均簽署知情同意書。

1.2 試劑 總RNA抽提采用Invitrogen公司的試劑盒；無RNA酶的糖原(Invitrogen公司)；cRNA標記與合成采用TrueLabeling-AMPTM線性RNA擴增試劑盒和SuperArray Array-Grade cRNA 純 化 試 劑 盒(貨 號 ：GA-012)；Biotin-16-dUTP(Roche Cat.No.1-093-070)；GEAhyb雜交液 (SuperArray Bioscience)；化學發光檢測試劑盒Chemiluminescent Detection Kit(SuperArray Bioscience，Catalog Number D-01)，異丙醇、氯仿、無水乙醇等均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取 以健康組皮膚樣本為對照，每100 mg銀屑病組與健康組皮膚樣品，采用Invitrogen公司的TRIZOL試劑一步法抽提皮膚樣品的總RNA，取少量液體用TE(10 mM Tris-HCl pH 8，1 mM EDTA)稀釋(1∶100稀釋)后，采用紫外吸收測定方法，讀取其在分光光度計260 nm和280 nm處的吸收值，采用變性瓊脂糖凝膠電泳，在紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的條帶，定量分析檢測RNA的質量，A260/A280在1.8～2.0之間，且前者的條帶約是后者條帶的2倍。

1.3.2 Affmetrix表達譜芯片實驗與數據分析 芯片的雜交在Oligo GEArray芯片雜交管中進行，采用預熱GEAhyb雜交液對生物素標記的cRNA樣品進行預雜交和雜交。芯片的化學發光檢測按照SuperArray公司提供的化學發光檢測試劑盒操作步驟進行。通過X膠片和臺式掃描儀獲得芯片圖像采集。使用綜合型GEArray表達分析配套軟件進行完整的芯片數據分析，從而獲得銀屑病組和健康組的差異基因。同時進行生物信息學分析，獲得每條基因的名稱及其基本生物學信息。利用Cluster 3.0軟件進行聚類分析。

2 結果

2.1 一般情況 將病理組織確認為銀屑病的皮損，同時按照RNA質量標準，將RNA質量合格者納入基因芯片實驗。

2.2 銀屑病基因表達差異(表1) Ratio值分析：對銀屑病組和正常對照組芯片中每張芯片上的所有基因的比值Ratio進行分析，得出銀屑病組和正常組間存在差異表達基因共105條。其中表達上調(Ratio值大于2)的有47條，表達水平下調(Ratio值小于0.5)的有58條。經檢索基因表達公共數據庫，獲得每條基因的名稱和其他基本信息表，其中表達上調幅度最大的基因為ABCC1，表1中列出若干銀屑病差異表達基因。

表1 銀屑病差異基因表達

3 討論

隨著對銀屑病發病機制認識的不斷深入，我們對銀屑病的認識較過去有了長足的進步，但至今仍不知道銀屑病發病機制中涉及的重要功能基因是如何發揮功能的，或者說它們是如何按照特定的時間、空間進行基因表達的，表達的量是多少，基因之間的調控關系是怎么樣。基因芯片是在核酸層次上研究基因表達的最新技術之一，可以大規模的對基因表達的個體特異性、組織特異性、發育階段的特異性、分化階段特異性、疾病特異性等進行綜合分析和判斷，基因芯片技術的出現，對極其復雜的生命現象及疾病研究提供了一種高通量、大規模、高度并行性、快速高效、高度靈敏、蘊藏高價值以及高度自動化的方法。銀屑病發病病因復雜，通過基因芯片技術挖掘到有趣的靶基因以及銀屑病的易感性基因位點，對更好地了解銀屑病的復雜的病因，發現新的銀屑病的治療靶點提供捷徑。Mee JB等[1]利用基因芯片技術，發現銀屑病與IL-1轉錄因子密切相關。本研究中ABCC1基因在銀屑病中表達上調，可能與銀屑病發病機制密切相關，其為ATP結合盒(ABC)藥物轉運蛋白。ABCC1是ABC轉運蛋白超家族成員，通過介導細胞內藥物排出、改變藥物在細胞內分布。這些跨膜轉運蛋白能夠利用ATP水解釋放能量而實現底物分子在胞膜內外的逆濃度梯度轉運[2]。夏天保等對60例銀屑病患者及60例健康對照者,分別用聚合酶鏈反應技術(PCR)及測序分析基因組DNA的突變等位基因，結果證實銀屑病組血小板活化因子乙酰水解酶基因突變率(Ala379Val)與健康人群差異無統計學意義(P＞0.05)[3]。銀屑病是一種表皮過度增生且炎性浸潤較為嚴重的反復復發的皮膚病，我們推測過度的表皮增生可能與機體皮膚細胞的能量代謝有關。該基因如何在銀屑病發病機制中傳導通路仍需后續的實驗研究。對銀屑病的基因學研究也有助于揭示臨床療效確切的藥物的可能作用機制。楊積順等研究發現芥子氣可抑制真皮成纖維細胞的增生,誘導其凋亡,該效應可能與芥子氣促進TRAILR1的表達有關[4]。同時對其誘導分泌TRAIL因子的時效和量效關系進行了深入探討[5]。在本研究中，我們本次的研究結果從基因組學的角度反映出銀屑病患者與健康人之間存在著差異表達基因，從差異值比較中可以找出銀屑病患者的標志基因，從而可以為銀屑病靶點藥物的研究提供理論基礎，也為進一步尋找銀屑病的生物標志物提供科學依據。

[1]Mee JB，Johnson CM，Morar N，et al.The psoriatic transcriptome closely resembles that induced by interleukin-1 in cultured keratinocytes:dominance of innate immune responses in psoriasis[J].Am J Pathol JT-The American journal of pathology，2007，171(1)：32-42.

[2]Dean M，Rzhetsky A，Allikmets R.The human ATP-binding cassette(ABC)transporter superfamily.Genome Res，2001，11(7)：1156-66.

[3]夏天保，呂世超，畢新嶺，等.PAF-AH基因突變與銀屑病的相關性研究[J].中國麻風皮膚病雜志，2008，24(9)：686-89.

[4]楊積順，胡晉紅，朱全剛，等.芥子氣誘導人真皮成纖維細胞的凋亡研究[J].藥學服務與研究，2009，9(3)：178-181.

[5]楊積順，徐立平，胡晉紅.芥子氣誘導真皮成纖維細胞分泌腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的時效和量效研究[J].中國藥業，2012，21(6)：29-30.