CCK-8和M TS法檢測人羊膜上皮細胞增殖的比較①

劉艷秋，張可華，王運良，舒峻，來薛，吳立群，曹善霞，李鴻，徐揚，高艷，崔曉惠，左和鳴，蔡哲

CCK-8和M TS法檢測人羊膜上皮細胞增殖的比較①

劉艷秋1a,2，張可華1a，王運良2，舒峻1a，來薛1a，吳立群1b，曹善霞1b，李鴻1a，徐揚1b，高艷1b，崔曉惠1b，左和鳴1a，蔡哲1a

目的 探討CCK-8、MTS兩種不同的四唑鹽試劑在羊膜上皮細胞增殖檢測中的最適實驗條件，并比較兩者細胞毒性。方法取體外培養對數生長期羊膜上皮細胞，用完全培養基(DMEM/F12+10%胎牛血清)配制成不同濃度的細胞懸液加入96孔板中培養24 h，分別加入CCK-8、MTS后于450 nm、492 nm波長處測定光密度(OD)。在同一細胞濃度下，根據同一波長不同時間檢測的OD確定CCK-8的最佳孵育時間。取體外培養的對數生長期羊膜上皮細胞分別用DMSO、CCK-8、MTS處理1 h、2 h、3 h和4 h后，繼續培養24 h，在450 nm處以CCK-8檢測細胞增殖，并通過臺盼藍染色計數活細胞數。結果CCK-8法的最佳波長為450 nm，MTS法的最佳波長為492 nm。CCK-8法靈敏度稍低于MTS法。1～4 h內，CCK-8試劑與待檢測細胞最佳孵育時間為4 h。CCK-8法對細胞增殖影響及細胞毒性均小于MTS法。結論CCK-8法是一種更為方便、細胞毒性作用較小的試劑。

MTS；CCK-8；羊膜上皮細胞；細胞增殖；細胞毒性

[本文著錄格式]劉艷秋，張可華，王運良，等.CCK-8和MTS法檢測人羊膜上皮細胞增殖的比較[J].中國康復理論與實踐, 2012,18(9):827-830.

人羊膜上皮細胞(human amniotic epithelial cells, hAECs)是胎盤羊膜組織靠近胎兒側的單層上皮細胞，來源于胚外外胚層。研究表明，hAECs內含多種干細胞樣細胞和前體細胞，具有明顯的可塑性和多分化潛能[1]。我們的實驗發現，hAECs具有神經干細胞樣特征，并且部分hAECs具有成熟多巴胺能神經元細胞的標志蛋白和分泌多巴胺的特性。hAECs無致瘤性，低免疫原性，系產后廢棄物，不涉及社會倫理學和生命倫理學問題。基于上述優點，hAECs成為細胞移植治療神經退行性疾病以及中樞神經系統損傷的潛在候選細胞。

從羊膜分離的hAECs可在體外進行傳代培養，最多可傳代至6代以上。隨著傳代次數增加，細胞的增殖活性隨之下降[1]。另外，不同培養條件對hAECs增殖也影響甚大。臨床細胞移植需要建立穩定可信的hAECs增殖活性檢測方法，因此實驗中常常需要hAECs的增殖檢測。自1983年M osmann建立MTT比色法[3]以來，由于其經濟、無放射性污染等特點，被大多數研究者用于細胞生長增殖及活性的檢測[4-5]。但其在操作過程中需加入二甲基亞砜(DMSO)溶解甲臜顆粒，且往往溶解不全而對實驗結果造成影響。近年來，國外研發出兩種新型的檢測方法：CCK-8法和MTS法[6-7]，其原理為活細胞線粒體脫氫酶轉化的黃色結晶為高度水溶性，不需要裂解細胞，可直接進行比色[8]。兩種方法步驟簡便，且準確性得到提高。由于hAECs屬于原代細胞，與大多數建系細胞株代謝特點和增殖活性有所不同，因此在檢測增殖時需要對各項實驗條件和參數進行有針對性的優化。

圖1 在波長450 nm下細胞濃度與OD的關系

圖2 在波長492 nm下細胞濃度與OD的關系

圖3 在敏感波長下CCK-8和M TS法OD比較

圖4 CCK-8不同孵育時間下OD比較

圖5 不同試劑下細胞OD(用CCK-8測定)

圖6 不同試劑下細胞形態(臺盼藍染色，40×)

1 材料與方法

1.1 材料 CCK-8試劑：日本同仁化學公司；MTS試劑：PROMEGA公司；DMSO試劑：GIBCO公司；0.4%臺盼藍染色：GIBCO公司；96孔板：COSTAR公司；MK 3型酶標儀：上海雷勃分析儀器有限公司；倒置顯微鏡：OLYMPUS公司；hAECs：中日友好醫院臨床研究所免疫室傳代保存。

1.2 方法

1.2.1 最佳波長 將對數生長期hAECs以每孔不同的細胞數(1×103、2×103、5×103、10×103)接種于96孔培養板中，平行接種2組，設3個復孔；每孔加完全培養基(DMEM/F12+10%胎牛血清)100μl。在37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，每孔換成DMEM/F12培養基100μl，一組每孔加入CCK-8試劑10μl，另一組每孔加入MTS試劑20μl，培養箱中孵育4 h。兩組分別在波長450 nm和492 nm下，用酶標儀檢測培養細胞的光密度(OD)。

1.2.2 靈敏度 前組細胞中，加入CCK-8的在450 nm波長條件下檢測吸光度，加入MTS試劑的在492 nm波長條件下檢測吸光度，比較細胞數目不同時兩種檢測方法檢測的OD。

1.2.3 CCK-8共同孵育時間對檢測結果的影響 將對數生長期的hAECs以每孔5×103接種于96孔培養板中，設3個復孔，每孔完全培養基(DMEM/F12+10%胎牛血清)100μl。在37℃、5%CO2培養箱中培養24 h；每孔換成DMEM/F12培養基100μl，分別加入CCK-8試劑10μl，再孵育1～4 h。450 nm波長酶標儀分別檢測共同孵育1 h、2 h、4 h時OD。

1.2.4 細胞毒性 將對數生長期的hAECs以每孔5×103接種于96孔培養板中，平行接種10組，設3個復孔，每孔完全培養基(DMEM/F12+10%胎牛血清)100μl。在37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，換成DMEM/ F12培養基100μl。陰性對照組不加任何試劑，陽性對照組加入DMSO試劑10μl，另外兩組分別加入CCK-8試劑10μl、MTS試劑20μl，在37℃、5%CO2培養箱中繼續培養1 h、2 h、3 h和4 h后，換成新鮮DMEM/F12培養液100μl，繼續于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。加入CCK-8 10μl，放置4 h后酶標儀450 nm波長下分別檢測各組細胞的增殖狀態。每孔培養液換成PBS 100μl，加入0.4%臺盼藍染色試劑5 μl，室溫放置5m in，倒置顯微鏡下觀察。

1.3 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件對數據進行Student-t檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 最佳波長 在細胞孵育時間相同的條件下，加入CCK-8與加入MTS的細胞OD都隨著細胞數的增加而增加。CCK-8在波長450 nm處隨細胞數增加，OD上升幅度更大，而MTS在波長492 nm處上升幅度更大(圖1、圖2)。CCK-8敏感波長為450 nm，MTS為492 nm。

2.2 靈敏度 在CCK-8和MTS各自敏感波長下檢測，隨著培養細胞數量的增加，OD均增加，相同細胞濃度下，MTS測量到的OD均略高于CCK-8(圖3)。

2.3 CCK-8與hAECs最佳共同孵育時間 CCK-8與培養細胞共同孵育，隨時間延長，OD逐漸增加(P＜0.001)(圖4)。

2.4 細胞毒性 在波長450 nm處，DMSO組OD低于陰性對照組(P＜0.05)，CCK-8組各時間點與陰性對照組無顯著性差異(P＞0.05)，MTS組2 h、3 h時OD呈明顯下降趨勢，且各時間點OD均低于陰性對照組(圖5)。

臺盼藍染色觀察，DMSO組細胞收縮變小，均發生藍染；MTS組部分細胞收縮并藍染；CCK-8組和陰性對照組細胞形態相似，無藍染細胞(圖6)。

3 討論

鑒于hAECs對神經系統退行性疾病的潛在治療作用和應用前景，對hAECs的增殖、分化、成瘤性等細胞學鑒定十分必要。

在細胞學研究領域，用于檢測細胞活性及增殖的方法主要有3H-TdR摻入法和MTT比色法。3H-TdR摻入法雖然靈敏度高、特異性強、穩定性好，但由于操作步驟多、存在放射性危害等限制了其使用。

MTT法的作用原理是MTT可作為哺乳類動物細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的底物；當活細胞存在時，線粒體內琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原成紫藍色的晶狀甲臜，加入二甲基亞砜(DMSO)將結晶的甲臜溶解釋放，再用酶聯儀測定吸光度OD。此法與3H-TdR摻入法比較具有操作簡便、無污染的特點。但需加入DMSO溶解才能比色，因此略顯繁瑣，且操作不當會給實驗帶來極大誤差。

近年來開發的四唑鹽，如MTS、CCK-8等可替代MTT法檢測細胞增殖。CCK-8試劑中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽(WST-8)，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-M ethoxy PMS)的作用下，被細胞中的乳酸脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜染料，生成的甲臜量與活細胞數成正比，且甲臜量可用酶標儀測定吸光度來衡量，利用此原理可進行簡便而準確的細胞增殖和活性分析[9-14]。MTS試劑由一種新型甲臜化合物2-對磺酸基苯基-3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲氧基苯基)-二氫四唑嗡鹽(MTS)和一個電子偶聯劑(吩嗪硫酸二甲酯)PMS組成。活細胞內的脫氫酶類將MTS轉化成液態可溶性甲臜化合物，甲臜化合物的量與培養基中活細胞數成正比，且甲臜的量可用酶標儀測定吸光度來衡量。與MTT相比，CCK-8、MTS可直接進行比色，實驗步驟簡便，也大大提高了實驗的敏感性，并且避免了DMSO對細胞的不良影響[15]。

本研究探討MTS、CCK-8在hAECs增殖檢測中的靈敏度、最佳波長、最適孵育時間，并且首次比較和探討了MTT、MTS和CCK-8對細胞的毒性。曾有實驗證明，在細胞濃度1.25×103～1.6×105/孔范圍內，CTLL-2細胞的活細胞數與OD450之間呈線性相關[16]。在本組實驗中，加入CCK-8試劑的hAECs，在2×103～10×103/孔范圍內，活細胞數與OD450值也呈線性關系；而MTS組細胞孵育一定時間后，OD雖然也隨細胞數的增加而增加，但線性關系與CCK-8相比稍差。

本實驗結果顯示，對于hAECs的增殖測定，MTS法靈敏度略高于CCK-8法，兩種方法均快速、操作簡便。由于MTT法需加入DMSO溶解甲臜顆粒，DMSO具有比較強烈的細胞毒性，DMSO組hAECs孵育4 h后出現固縮，臺盼藍可染成藍色，表明可能發生細胞凋亡或壞死。MTS組hAECs孵育4 h后細胞增殖受到抑制，但細胞形態無明顯變化。CCK-8組 hAECs，細胞增殖及形態均無明顯變化。表明CCK-8的細胞毒性在同類試劑中最小。

綜上所述，CCK-8和MTS均能較好檢測hAECs的體外增殖。相對于MTS法，CCK-8法是一種更經濟、細胞毒性作用較弱的檢測試劑，值得推廣使用。

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Com parison of Experim ental Conditions of CCK-8 and M TS for Hum an Am niotic Epithelial Cells Proliferation Assay

LIU Yan-qiu,ZHANG Ke-hua,WANG Yun-liang,etal.Department of Immunology,Institute ofClinicalMedicine,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China

Ob jectiveTo explore the optimal experiment conditions of CCK-8 and MTS for cell proliferation assays in human amniotic epithelial cells and to evaluate the cytotoxicity of these reagents.M ethodsHuman amniotic epithelial cells(hAECs)in logarithm grow th stages were prepared in different cell concentrations w ith DMEM/F12 and 10%FBS.The sensitivity and optimalwavelengths was determ ined based on the optical density(OD)measured at 450 nm and 492 nm.The optimal time was determ ined under the conditions of the same cell concentration and defined OD values.HAECswere treated w ith DMSO,CCK-8 and MTS for 1 h,2 h,3 h,and 4 h,respectively. 24 h later,cytotoxicity of the CCK-8 and MTSwas evaluated by determ ination of cell proliferation and Trypan Blue staining.Resu ltsThe optimal detection wavelength was 450 nm for CCK-8,and 492 nm for MTS.The sensitivity of CCK-8 was slightly lower then thatof MTS. The optimal time for incubation hAECs w ith CCK-8 was 4 h w ithin 1～4 h.The inhibitory on cell proliferation and cytotoxicity of CCK-8 were weaker then those of MTS.ConclusionCCK-8 is a convenient reagent w ith low cytotoxicity for detection of the proliferation of hAECs.

MTS;CCK-8;amniotic epithelial cells;cell proliferation;cytotoxicity

R446.61

A

1006-9771(2012)09-0827-04

2012-04-25

2012-04-27)

1.中日友好醫院，a.臨床醫學研究所免疫學研究室；b.婦產科，北京市100029；2.中國人民解放軍第148中心醫院神經內科，山東淄博市255300。作者簡介：劉艷秋(1984-)，女，山東淄博市人，碩士研究生，醫師，主要研究方向：神經病學。通訊作者：蔡哲。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.09.010