體外沖擊波對(duì)兔膝軟骨細(xì)胞增殖的影響①

趙喆，劉春梅，白曉東，邢更彥

體外沖擊波對(duì)兔膝軟骨細(xì)胞增殖的影響①

趙喆1,2，劉春梅1，白曉東1，邢更彥1

目的 體外觀察體外沖擊波(ESW)對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響。方法酶法消化獲得正常兔膝軟骨細(xì)胞，體外分別施加0、1×105、1.5×105、2×105、2.5×105、3×105、3.5×105Pa ESW 0、300、600、900次。倒置顯微鏡觀察，HE染色觀察，CCK-8染色篩選ESW促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖最佳壓強(qiáng)和次數(shù)。結(jié)果1.5×105Pa、600次ESW干預(yù)后，軟骨細(xì)胞增殖活性達(dá)最高；隨壓強(qiáng)、次數(shù)升高，軟骨細(xì)胞增殖活性明顯下降。結(jié)論軟骨細(xì)胞是對(duì)ESW應(yīng)力敏感細(xì)胞。ESW在一定壓強(qiáng)和次數(shù)下顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。

體外沖擊波；軟骨細(xì)胞；細(xì)胞增殖；應(yīng)力細(xì)胞

[本文著錄格式]趙喆，劉春梅，白曉東，等.體外沖擊波對(duì)兔膝軟骨細(xì)胞增殖的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(9): 824-826.

體外沖擊波療法(extracorporeal shock wave therapy,ESWT)作為骨科新的非侵入性治療方法，在治療某些軟組織和骨疾病方面較傳統(tǒng)方法存在優(yōu)勢(shì)[1]。臨床研究顯示，ESWT治療距骨軟骨損傷取得顯著療效，具有創(chuàng)傷小、方法簡(jiǎn)單、患者易于接受等優(yōu)點(diǎn)[2]。2008年，國際骨肌系統(tǒng)沖擊波療法聯(lián)合會(huì)(International Society for Medical Shockwave Treatment, ISMST)將距骨軟骨損傷納入其適應(yīng)癥。本研究體外觀察ESW對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡新西蘭兔3只：解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心；胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、CCK-8試劑盒：美國SIGMA公司；Ⅱ型膠原酶：美國GIBCO公司；氣壓彈道式?jīng)_擊波儀：瑞士EMS公司。

1.2 軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng) 新西蘭兔過量麻醉處死，酶法消化獲得兔膝軟骨細(xì)胞[3]，培養(yǎng)至第一代。將軟骨細(xì)胞調(diào)整到2000/m l備用。

1.3 ESW干預(yù) 將2000/m l軟骨細(xì)胞懸液分別移入7個(gè)5 cm2培養(yǎng)皿中各5m l。封口膜密封培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿水平放置在氣壓彈道式?jīng)_擊波探頭上，中間放置橡膠囊并均勻涂抹耦合劑。施以0、1×105、1.5×105、2×105、2.5×105、3×105、3.5×105Pa ESW 600次。培養(yǎng)皿移入超凈臺(tái)，去除封口膜，取細(xì)胞懸液100μl移入96孔培養(yǎng)板，每孔設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育48 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，確定ESW促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的最佳壓強(qiáng)。以此壓強(qiáng)分別對(duì)第一代軟骨細(xì)胞干預(yù)300、600、900次。CCK-8法檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖情況，確定最佳次數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 CCK-8法 孵育后細(xì)胞加入CCK-8 10μl，水平方向輕輕搖勻，再培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。

1.4.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和HE染色 根據(jù)篩選出的ESW促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖最佳參數(shù)干預(yù)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，對(duì)照組不給予任何干預(yù)。細(xì)胞接種到預(yù)先置有滅菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱孵育72 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。貼壁細(xì)胞行HE染色，倒置顯微鏡鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下，原代軟骨細(xì)胞呈輪廓清晰的圓形，懸浮在培養(yǎng)液中。4 h后大部分細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞逐漸扁平透亮。24 h后軟骨細(xì)胞出現(xiàn)突起，逐漸變成多邊形。2 d后，軟骨細(xì)胞連片生長，邊緣細(xì)胞突起較長，細(xì)胞偏梭形，中央的細(xì)胞突起較短，呈多角形，似鋪路石樣改變。

2.2 ESW促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖最佳壓強(qiáng) 在沖擊次數(shù)固定為600次時(shí)，壓強(qiáng)為1.5×105Pa時(shí)細(xì)胞增殖活性達(dá)到最高。同1.5×105Pa時(shí)比較，0×105、2.5×105、3×105、3.5×105Pa時(shí)細(xì)胞增殖活性下降(P＜0.05)。見圖1。

2.3 ESW促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖最佳次數(shù) 壓強(qiáng)固定為1.5×105Pa時(shí)，沖擊600次軟骨細(xì)胞增殖活性達(dá)最高。600次與0次比較，軟骨細(xì)胞增殖活性有顯著性差異(P＜0.05)，與900次比較無顯著性差異(P＞0.05)。

2.4 HE染色 對(duì)照組軟骨細(xì)胞呈三角型、梭型，胞漿較少、紅染，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，較小，核仁不明顯(圖3)。實(shí)驗(yàn)組軟骨細(xì)胞呈多角型，胞漿豐富、紅染，伸出多個(gè)長的足突，細(xì)胞核較大，可見2～3個(gè)核仁(圖4)。

圖1 不同壓強(qiáng)ESW下軟骨細(xì)胞增殖活性

圖3 對(duì)照組(HE染色,100×)

圖4 實(shí)驗(yàn)組(HE染色,100×)

3 討論

軟骨細(xì)胞作為成熟軟骨中唯一的細(xì)胞類型，在軟骨損傷修復(fù)過程中起到維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。越來越多的研究表明，軟骨細(xì)胞增殖同軟骨損傷疾病的預(yù)后密切相關(guān)，而軟骨細(xì)胞的增殖、分化與細(xì)胞所受力學(xué)刺激密切相關(guān)[4]。當(dāng)軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)和失去外界應(yīng)力作用時(shí)，其正常功能、狀態(tài)發(fā)生改變。Wu等通過三維培養(yǎng)原代人軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)機(jī)械刺激可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，同時(shí)證明加入鈣離子阻斷劑可抑制細(xì)胞增殖[5]。伏治國等發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)軟骨細(xì)胞具有明顯的力學(xué)保護(hù)作用，壓縮應(yīng)力會(huì)影響軟骨細(xì)胞的代謝活動(dòng)[6]。

體外沖擊波是一種連續(xù)的單一脈沖波，具有高壓、壓力驟升(＜10 ns)、短周期(10μs)的特點(diǎn)。沖擊波由適當(dāng)?shù)恼袷幇l(fā)生器產(chǎn)生，通過不同聲阻抗的物質(zhì)界面形成反射和折射。由于阻抗大的吸收壓強(qiáng)多，阻抗小的吸收壓強(qiáng)少，產(chǎn)生不同的效應(yīng)。本研究顯示，軟骨細(xì)胞在1.5×105Pa、600次ESW干預(yù)下，增殖活性較對(duì)照組明顯加快。另外，實(shí)驗(yàn)也表明，ESW只有在沖擊次數(shù)達(dá)一定量時(shí)才能表現(xiàn)出促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的效應(yīng)，而沖擊次數(shù)過度又將抑制細(xì)胞增殖，提示存在累積效應(yīng)。王五洲等研究ESW對(duì)對(duì)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)5 kV、100次ESW可以明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖及成骨活性[7]。王明波等發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)壓強(qiáng)ESW具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞促增殖因子堿性成纖維細(xì)胞生長因子和結(jié)締組織生長因子的表達(dá)[8]。前者被認(rèn)為是對(duì)軟骨細(xì)胞作用最強(qiáng)的有絲分裂原，可顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，而結(jié)締組織生長因子在促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。Renz等發(fā)現(xiàn)，ESW對(duì)藻酸鹽中軟骨細(xì)胞的膜通透性和DNA碎片情況無顯著影響，認(rèn)為ESW的臨床應(yīng)用對(duì)軟骨細(xì)胞無副作用[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，軟骨細(xì)胞是一種對(duì)ESW應(yīng)力敏感的細(xì)胞，在特定壓強(qiáng)和沖擊次數(shù)下可引起軟骨細(xì)胞明顯增殖，具有壓強(qiáng)依賴性和積累效應(yīng)。

軟骨細(xì)胞如何將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化成為細(xì)胞生長、分泌和代謝等化學(xué)信號(hào)的具體過程，目前還不清楚。其主要調(diào)控機(jī)制可能是細(xì)胞骨架的改變，以及所導(dǎo)致的一系列分子信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的生長、分裂、蛋白質(zhì)合成與分泌等的調(diào)控[10]。機(jī)械應(yīng)力可使細(xì)胞外基質(zhì)的間隙水流出，繼而使細(xì)胞骨架發(fā)生位移與形變。Ingber等認(rèn)為，機(jī)械信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)比較復(fù)雜的過程，在歸納了最近的一些實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，提出外來應(yīng)力首先作用于細(xì)胞骨架，使其發(fā)生移位或變形；而細(xì)胞骨架中的整合素與細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，使細(xì)胞膜附近的局部粘連復(fù)合體發(fā)生改變，而局部粘連復(fù)合體與細(xì)胞骨架相連就會(huì)發(fā)生基于上述應(yīng)力的細(xì)胞骨架形態(tài)改變以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的激活[11]。軟骨細(xì)胞如何將ESW這一機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化成促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，仍需深入研究。

綜上所述，ESW作為機(jī)械應(yīng)力在一定壓強(qiáng)和次數(shù)的情況下顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。證實(shí)軟骨細(xì)胞是ESW應(yīng)力敏感細(xì)胞，具有壓強(qiáng)依賴性和積累效應(yīng)。可供目前應(yīng)用ESW治療軟骨損傷選用適當(dāng)壓強(qiáng)和次數(shù)時(shí)提供參考。

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Effect of Extracorporeal Shock Wave on Chondrocyte Proliferation of Rabbit Knee in Vitro

ZHAO Zhe,LIU Chun-mei,BAI Xiao-dong,etal.DepartmentofOrthopaedic Surgery,GeneralHospital ofChinese People's Army Police Forces,Beijing 100039,China

ObjectiveTo observe the effect of extracorporeal shock wave(ESW)on proliferation of chondrocyte in vitro.M ethodsChondrocyte from normal rabbit knee using enzymatic digestion was treated w ith ESW of 0,1×105,1.5×105,2×105,2.5×105,3×105,3.5×105Pa 0,300,600,900 times in vitro.The pressure and frequency of ESW most promoting chondrocyte proliferation were determ ined w ith cartilage cellmorphology,HE staining and CCK-8 assay.Resu ltsChondrocyte proliferated most under 1.5×105Pa and 600 times of ESW,and decreased as the pressure and the frequency increased.Conclusion Chondrocyte is stress-sensitive in vitro.ESW can promote chondrocyte proliferation in certain pressure and frequency.

extracorporeal shock wave;chondrocyte;proliferation;stress cells

R681.3

A

1006-9771(2012)09-0824-03

2012-03-29

2012-06-05)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172169)。

1.武警總醫(yī)院骨科，北京市100039；2.武警山西總隊(duì)朔州支隊(duì)，山西朔州市036002。作者簡(jiǎn)介：趙喆(1982-)，男，山西晉中市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：關(guān)節(jié)外科，軟骨損傷與修復(fù)。通訊作者：邢更彥。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.09.009