高壓氧對大鼠脊髓損傷后局部炎癥因子的影響*

王 波，方以群，張存海

(1.解放軍第117醫院，浙江 杭州 310013;2.海軍醫學研究所，上海 200433)

隨著現代交通事故的增多，體育運動損傷的漸增，以及其他一些致傷因素的存在，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)呈顯著增加的趨勢，極大地危害著人類健康。目前對脊髓損傷的治療成為了世界各國科研工作中的熱點。但是由于神經元的生存能力差，神經軸突缺乏自發的再生能力及脊髓斷端的抑制性生長環境，主要是炎性環境，導致中樞神經系統的自我修復能力非常有限。高壓氧作為脊髓損傷后的有效輔助康復手段，臨床上已有大量的文獻報道，但具體干預機制尚未明確。本實驗以SD大鼠作為研究對象，建立不完全性脊髓損傷模型，觀測高壓氧治療是否可通過減輕脊髓斷端的炎性反應，促進動物行動功能的恢復。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

45只健康雄性SD大鼠購自上海西普爾畢凱實驗動物有限公司，平均體重(250±2.81)g，海軍醫學研究所動物飼養中心飼養。實驗動物隨機分為3組(n=15):假手術組，單純暴露脊髓;脊髓損傷對照組;高壓氧治療組:脊髓損傷術后12 h內行高壓氧治療，大鼠呼吸 2絕對大氣壓(absolute atmosphere，ATA)的100%O2，每天 90min，治療維持至移植后2周。

1.2 主要試劑

大鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、γ干擾素(IFN-γ)酶鏈免疫(ELISA)試劑盒購自美國Ebiosience公司。

1.3 不完全性脊髓損傷大鼠模型的建立

參照改良的Allen重物打擊法制作大鼠脊髓背側損傷模型:實驗前大鼠禁食8 h，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部脫毛后俯臥位固定于手術臺上，常規消毒，腰背部正中切口，逐層分開顯露T8-T10椎板，行T9全椎板切除，暴露硬脊膜，鉗夾固定T8及T10棘突，用10g的不銹鋼棒(直徑為2.5 mm)沿帶有刻度的玻璃導管從25 mm高處垂直下落，打擊在由塑料材料制成的底部呈凹面、直徑為3 mm的撞桿上，后者將打擊力傳遞給脊髓，造成大鼠脊髓不完全損傷，致傷后迅速移開打擊物，逐層縫合。模型成功的判斷標準:打擊后損傷處脊髓出血、水腫，大鼠出現擺尾反射，雙下肢及軀體回縮樣撲動，麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。

1.4 運動功能評定

活動能力評定采用開放區行走評分系統。應用BBB評分系統(Basso，Bresnahan&Bresnahan locomotor rating scale，BBB scale)評定動作能力的恢復[1]。分別在手術后1、2、3、4周進行盲法BBB評分，由兩名熟悉BBB評分標準的非實驗人員觀察。將動物置于直徑1m的平面光滑場地自由活動5min，觀察記錄其后肢的行走及肢體活動。評分分三部分:第一部分為0～7分，評判動物后肢各關節活動;第二部分為8～13分，評判后肢的步態及協調功能;第三部分為14～21分，評判運動中爪的精細動作，三項滿分為21分。

1.5 炎癥因子的檢測

手術后14 d，以T8-T10損傷段為中心取材，切取頭尾段在內的1 cm長脊髓組織，每組5個，置于SDS緩沖液中勻漿，12000×g離心10min后，取上清，各100μl加入96孔板中，4℃過夜，1%BSA 封閉后，和抗TNF-a，IL-6、IFN-γ的抗體，37℃下孵育6 h后，加入二抗，450nm處測定吸收光度。

1.6 統計學分析

結果采用SPSS 11.5軟件處理，觀察數據以均數±標準差()表示，2個以上樣本均數的比較采用方差分析。

2 結果

2.1 HBO對大鼠神經功能恢復的影響

高壓氧組和非高壓氧組相比各時間點BBB評分值差異明顯(P＜0.05，表1)，說明高壓氧對損傷的脊髓組織有保護作用。

Tab.1 BBB scores of rats at different points post spinal cord injury(，n=15)

Tab.1 BBB scores of rats at different points post spinal cord injury(，n=15)

HBO:Hyperbaric oxygen*P＜0.05 vs model group

Group 1Week 2Week 3Week 4Week False injury 21 21 21 21 Model 1.2±0.82.5±1.04.5±0.74.9±0.6 HBO 2.3±0.85.2±0.9*8.1±0.6*8.8±0.8*

2.2 HBO對大鼠脊髓組織炎性因子表達的影響

ELISA結果顯示，手術后第 14 d，相對于假手術組，模型組大鼠脊髓組織中炎癥因子顯著增高，經高壓氧處理后，炎癥因子含量明顯減少(表2)。

Tab.2 Change of inflammation cytokines in inpaired spinal cord(pg/ml，，n=5)

Tab.2 Change of inflammation cytokines in inpaired spinal cord(pg/ml，，n=5)

HBO:Hyperbaric oxygen*P＜0.05，**P＜0.01 vs false injury group;#P＜0.05 vs model group

Group TNF-α IL-6 IFN-γ False injury 45.18±7.21 78.92±17.23 26.59±4.23 Model 121.67±4.76**157.45±11.34*106.73±5.93**HBO 87.32±6.98# 98.95±10.21#87.39±6.38#

3 討論

炎癥在脊髓損傷的發病過程中起著重要作用，局部損傷組織的炎性反應可加重繼發性脊髓損傷的程度[2]。局部損傷后引起的繼發性炎性環境會促使損傷脊髓處的細胞發生壞死和凋亡，而出現不可逆性的病理改變，從而加重脊髓損傷。Trivedi等報導中性粒細胞可通過向損傷部位聚集，釋放彈性蛋白酶等物質，加重組織水腫、壞死、促進神經元和少突膠質細胞凋亡，導致局部出現膠質瘢痕[3]。本研究中發現，在損傷后14天，局部損傷組織中炎癥因子:TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量顯著增高。

高壓氧長期以來廣泛用于脊髓損傷的治療，HBO可迅速糾正損傷組織的缺氧狀態，使缺血組織的血流加快、血管擴張、微循環障礙得到糾正，從而可有效清除自由基，抑制氧自由基介導的脂質過氧化[4]。HBO可通過對單核-巨噬細胞前致炎性因子的合成抑制，達到抗炎癥反應及免疫調節作用[5]。

本研究中發現采用HBO治療脊髓損傷的大鼠后，在治療后2周，治療組大鼠的BBB評分顯著上升，和模型組比較具有顯著的差異性，證明高壓氧對脊髓損傷具有一定的干預性。同時局部脊髓組織勻漿后，經ELISA檢測發現炎癥因子顯著下降，證實HBO可通過拮抗局部損傷組織的炎癥反應，達到免疫調節的作用，從而抑制炎癥因子引起的脊髓繼發性損傷，改善局部的神經恢復。

因為免疫炎性反應在脊髓損傷早期異常活躍，并在繼發性脊髓損傷中扮演著重要的角色。通過對本實驗中脊髓損傷2周時損傷局部炎性因子的檢測，我們發現HBO及時的早期干預可有效抑制損傷部位的免疫炎性反應，因此HBO對脊髓損傷早期救治起著重要作用。

[1]Basso D M，BeattieM S，Bresnahan J C.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].J Neurotrauma，1995，12(1):1-21.

[2]Beattie M S.Inflammation and apoptosis:linked therapeutic targets in spinal cord injury[J].Trends Mol Med，2004，10(12):580-583.

[3]Trivedi A，Olivas A D.Noble-haensslein L.Inflammation and Spinal Cord Injury:Infiltrating Leukocytes as Determinants of Injury and Repair Processes[J].Clin Neurosci Res，2006，6(5):283-292.

[4]Al-Waili N，Butler G S，Beale J，et al.Hyperbaric oxygen in the treatment of patients with cerebral stroke，brain trauma，and neurologic disease[J].Adv Ther，2005，22(6):659-678.

[5]Milovanova T N，Bhopale V M，Sorokina E M.Hyperbaric oxygen stimulates vasculogenic stem cell growth and differentiation in vivo[J].J Appl Physiol，2009，106(2):711-728.