肉堿對大鼠力竭運動后心肌線粒體呼吸鏈功能及抗氧化能力的影響＊

李 潔,余小燕

(1.西北師范大學體育學院,甘肅 蘭州 730070;2.青海省體育科學研究所,西寧 810000)

肉毒堿(Carnitine),簡稱肉堿,又稱卡尼汀,有L型和D型,其中只有L-肉堿(L-Carnitine)具有生物活性,D型是其競爭性抑制劑。一般而言,肉堿均指L-肉堿。肉堿是線粒體膜上轉運活化的長鏈脂肪酸穿過線粒體內膜,進入β-氧化酶活躍的線粒體基質的唯一載體,在能量代謝的調節中起著重要的作用。近年來,肉堿的補充在運動實踐中的應用價值引人注意,不斷有人從理論和實際使用中進行探討[1]。已有研究表明,實驗組運動員有氧能力的改善主要是由于組織內脂肪供能的加強所致,而適當補充肉堿可能正是改善脂肪代謝的關鍵。心肌細胞供能的主要方式是依賴發生于線粒體有氧條件下的脂肪酸β-氧化,而非糖氧化代謝,這一與其他組織絕然不同的供能方式決定了心肌細胞內脂肪酸代謝的至關重要性[2]。肉堿具有提高心肌線粒體呼吸酶活性及保護線粒體膜結構的作用,通過保護呼吸鏈的完整性,改善了心肌氧化磷酸化功能[3]。但目前研究尚未涉及運動過程中補充肉堿對心肌細胞生物氧化的影響。本研究擬采用補充肉堿和/或運動訓練的手段,通過測定大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶及抗氧化酶活性,探討肉堿對大鼠心肌線粒體能量代謝的影響,以期為肉堿在運動實踐中的應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

雄性健康2月齡Wistar大鼠50只[由蘭州大學醫學院實驗動物中心提供,動物生產許可證:SCXK(甘)2005-0007],體重130g左右。國家標準嚙齒類動物飼料喂養,自由攝食飲水,室溫(23±2)℃,相對濕度50%±10%,自然采光,飼養室、用具等每周用紫外燈滅菌一次。

大鼠購入后在動物房飼養3 d,以適應環境,然后進行每天一次、共2 d的水平跑臺適應性訓練,每次運動強度從10m/min開始遞增到12 m/min,運動時間20min,使大鼠熟悉跑臺。根據體重和跑臺運動適應情況,淘汰體重過重或過輕及不適應跑臺運動的大鼠,保留40只大鼠進行正式實驗。將篩選出的40只大鼠隨機分為4組(n=10):對照組(C),補充肉堿組(LC),運動訓練組(T),運動訓練+補充肉堿組(T LC)。

1.2 肉堿補充方法

LC組和 T LC組大鼠每天按300mg/kg bw劑量[4]灌胃補充L-肉堿一次,其余大鼠灌胃同體積的蒸餾水。

1.3 訓練安排

C組和LC組不進行運動訓練。T組和T LC組采用遞增負荷水平跑臺運動,第1周速度為 15 m/min,運動時間20min/d;第2周速度為20m/min,運動時間20min/d;第3～4周速度為25 m/min,運動時間40min/d;第5～6周速度為25 m/min,運動時間60min/d。每周訓練6 d,共訓練6周。

1.4 取樣及線粒體制備

第7周周一,各組大鼠分別進行速度為30m/min的水平跑臺力竭運動,并記錄力竭運動時間。力竭標準為:大鼠跟不上預訂跑臺速度,腹部與跑道面接觸,后肢蹬地無力,毛刷刺激驅趕無效,降低跑臺速度后,仍無力繼續運動;行為特征為呼吸深急、幅度大,精神疲倦,俯臥位垂頭,表情冷漠、反應遲鈍、基本無逃避反應。力竭運動后即刻斷頭處死大鼠,于冰盤上迅速取出心臟,在冷生理鹽水中洗滌三次以上盡可能減少殘留血液,濾紙吸干稱重后置于液氮中冷凍,-20℃低溫保存待用。按文獻勻漿和提取心肌線粒體[5]。

1.5 測試指標及方法

(1)線粒體呼吸鏈酶活性的測定:參照Vyatlina等[6]的方法。(2)蛋白濃度測定:牛血清白蛋白為標準,考馬斯亮藍法測定。(3)抗氧化酶活性的測定:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的檢測方法嚴格按試劑盒說明的操作程序進行。

1.6 試劑與藥品

L-Carnitine、DB(2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1,4-benzoquinone)、NADH(nicotinamide adenine dinuclectide-reduced)、rotenone、cytochrome 、antimycin 、BSA(bull serum albumin),CBB(coomassiebrilliantblue)均為sigma公司產品,DCPIP(2,6-dichlorophenolindophenol)為Fluka公司產品,超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)測試盒為南京建成生物工程研究所提供,其余為國產分析純試劑。

1.7 主要儀器

UNIVERSAL 32R臺式高速冷凍離心機(德國),UV754N紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 補充肉堿和運動訓練對大鼠力竭運動時間的影響

各組大鼠力竭運動時間(min)為:C組158.6±11.2,LC組172.3±23.4,T組201.9±15.7,T LC組226.8±36.5。與C組相比,LC組大鼠跑臺運動至力竭時間延長8.6%,但無顯著性變化,T組和T LC組顯著延長,分別延長27.3%(P<0.05)和43%(P<0.01)。與LC組相比,T LC組顯著延長,延長31.6%(P<0.05)。與 T組相比,T LC組延長12.3%,但無顯著性變化。

2.2 大鼠心肌線粒體呼吸鏈CⅠ～Ⅳ活性的比較

CⅠ活性變化:與C組相比,LC、T和 T LC組均顯著升高(P<0.05,P<0.01),分別升高21.5%(P<0.05)、44.1%(P<0.01)和 88.2%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著升高(P<0.01),升高54.9%;與T組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高30.6%。CⅡ活性變化:與C組相比,LC組升高44.8%,但無顯著性變化,T和T LC組顯著升高,分別升高82.8%(P<0.05)和131.0%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高59.5%;與T組相比,T LC組升高26.4%,但無顯著性變化。CⅢ活性變化:與C組相比,LC組升高13.4%,但無顯著性變化,T和T LC組顯著升高,分別升高48.8%(P<0.05)和79.1%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高57.9%;與T組相比,T LC組升高20.3%,但無顯著性變化。CⅣ活性變化:與C組相比,LC、T和T LC組均顯著升高,分別升高62.9%(P<0.05)、88.3%(P<0.01)和 221.1%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高97.1%;與T組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高 70.6%(表 1)。

Tab.1 Activity of respiratory chain complexes in mitochondria of rat myocardium after exhaustive running(μmol/(mg pro·min),,n=10)

Tab.1 Activity of respiratory chain complexes in mitochondria of rat myocardium after exhaustive running(μmol/(mg pro·min),,n=10)

CⅠ:Respiratory chain complexesⅠ;CⅡ:Respiratory chain complexesⅡ;CⅢ:Respiratory chain complexesⅢ;CⅣ:Respiratory chain complexesⅣ＊P<0.05,＊＊P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsLC group; △P<0.05vsT group

2.3 大鼠心肌線粒體SOD活性及MDA含量的比較

SOD活性變化:與C組相比,LC、T和 T LC組均顯著升高,分別升高29.8%(P<0.05)、43.0%(P<0.05)和63.9%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高26.3%;與 T組相比,T LC組顯著升高(P<0.05),升高14.6%。MDA含量變化:與C組相比,LC、T和T LC組均顯著降低,分別降低 18.8%(P<0.05)、14.6%(P<0.05)和 25.6%(P<0.01);與LC組相比,T LC組顯著降低(P<0.05),降低8.4%;與T組相比,T LC組顯著降低(P<0.05),降低 12.9%(表 2)。

Tab.2 Activity of SOD and the content of MDA in mitochondria of rat myocardium after exhaustive running(,n=10)

Tab.2 Activity of SOD and the content of MDA in mitochondria of rat myocardium after exhaustive running(,n=10)

SOD:Suproxide dismutase;MDA:Malondialdehyde＊P<0.05,＊＊P<0.01vsC group;#P<0.05vsLC group;△P<0.05vsT group

Group SOD activity(U/mg pro) MDA content(nmol/mg pro)C 16.21±2.39 11.04±0.73 LC 21.04±1.13＊ 8.96±0.42＊T 23.18±2.04＊ 9.43±0.37＊T LC 26.57 ±3.01＊＊#△ 8.21 ±0.25＊＊#△

3 討論

一般情況下,正常人能夠通過自身合成和消化道的吸收滿足自身需要的肉堿,但由于某些先天性疾病或代謝性疾病以及運動導致代謝加強可引起肉堿缺乏,從而影響正常的生理機能和運動能力的發揮[7]。已有研究表明,補充肉堿能夠顯著提高人體無氧閾下的做功能力、每搏耗氧量;顯著降低呼吸商、運動后的血乳酸值、二氧化碳生成等,從而延緩運動性疲勞,提高機體的有氧運動能力[8]。運動員服用肉堿,可提高機體血紅蛋白和血漿睪酮水平,長期使用能改善心臟功能,加速脂肪氧化分解供能,提高機體的有氧運動能力等[9]。

3.1 補充肉堿及運動訓練對大鼠力竭運動時間的影響

大鼠跑臺至力竭的時間是反映運動能力的常用指標,運動能力的提高是機體抗疲勞能力加強最有力的宏觀體現。已有研究表明,補充肉堿可以明顯延長大鼠游泳至力竭的時間[10]。本研究結果顯示,LC組、T組和 T LC組大鼠跑臺力竭時間均高于C組,其中T組和 T LC組具有顯著性變化,且 T LC組效果最佳。表明補充肉堿、運動訓練均可提高機體運動能力,且補充肉堿與運動訓練具有協同作用。可能是補充肉堿改善了在耐力性運動中脂肪供能能力和機體對運動刺激的適應。

3.2 補充肉堿及運動訓練對大鼠力竭運動后即刻心肌線粒體呼吸鏈功能的影響

肉堿作為轉運活化長鏈脂肪酸進入線粒體的載體,促進脂肪酸的β-氧化,間接促進檸檬酸循環。β-氧化和檸檬酸循環所形成的還原型輔酶,包括NADH和FADH2通過電子傳遞途徑被重新氧化。還原型輔酶上的氫原子以質子形式脫下,其電子沿著呼吸鏈傳遞到分子氧。質子和離子型氧結合而成水。在電子傳遞過程中釋放出大量自由能則使ADP磷酸化生成ATP。因此,呼吸鏈酶活性變化能夠間接反應ATP的生成速率。

已有研究表明[3],肉堿具有提高線粒體呼吸酶活性及保護線粒體膜結構的作用,通過保護呼吸鏈的完整性,改善了心肌氧化磷酸化功能。本研究結果顯示,與C組相比,LC組可提高大鼠心肌線粒體呼吸鏈CⅠ～Ⅳ活性,只是CⅡ和CⅢ活性無顯著性變化。表明補充肉堿可改善線粒體呼吸鏈酶活性尤其是起始端酶和末端氧化酶的活性,從而間接改善心肌氧化磷酸化功能。其機制可能是由于補充肉堿可緩解因長時間的運動而造成必需肉堿的減少。β-氧化的速度很大程度上取決于可利用的肉堿量,高濃度的肉堿能增加脂肪的氧化速度[4]。在一次性力竭運動中肉堿將長鏈脂肪從線粒體膜外運送到膜內,促進脂肪酸的β-氧化,增大了檸檬酸循環的流通量,使CⅠ的反應底物NADH的量及供氧量增加所致。與C組相比,T組可使大鼠心肌線粒體呼吸鏈CⅠ～Ⅳ活性顯著升高。表明適宜的運動訓練可以使心肌線粒體呼吸鏈酶出現適應性變化,使其活性得到提高。其機制可能是運動訓練調節了脂肪酸轉運步驟及脂肪酸氧化酶的活性,使參與檸檬酸循環及呼吸鏈酶的數量和活性增加,提高了脂肪能量的利用率。T LC組與C組和LC組相比,大鼠心肌線粒體呼吸鏈CⅠ～Ⅳ活性均顯著升高。與T組相比,CⅠ～Ⅳ活性升高,只是CⅡ和CⅢ活性無顯著性變化。表明運動訓練復合補充肉堿可有效的改善線粒體呼吸鏈酶復合體的活性,且補充肉堿與運動訓練具有協同作用。

3.3 補充肉堿及運動訓練對大鼠力竭運動后即刻心肌線粒體抗氧化能力的影響

長期運動訓練之所以使機體受自由基損傷的程度不大,其機制可能是(1)有氧訓練可使機體心肺功能增強,組織氧利用率提高,從而減少因有氧氧化系統過度負荷和組織器官相對缺血缺氧所致的自由基生成。(2)由于抗氧化酶是在氧化應激增強的情況下誘導產生的,長期有氧訓練使機體的氧化應激程度提高,激發機體的抗應激能力,也即抗氧化酶活性升高使體內的自由基防御系統保持一個較高的水平。

補充肉堿提高機體抗氧化能力的機制可能是:(1)肉堿對抗脂質過氧化物酶例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶起到抗氧化劑的作用;(2)通過穩定生物膜,將膜重組為對自由基抗性大的膜起到抗氧化作用。長鏈脂酰CoA具有表面活性劑作用,對以脂質為主要組成成分的生物膜起破壞作用。肉堿與長鏈脂酰CoA反應生成長鏈脂酰肉堿,促使長鏈脂酰CoA的氧化利用,從而達到穩定生物膜的作用;(3)可幫助脂溶性抗氧化劑越過線粒體。機體內95%的自由基在線粒體內產生,而大多數抗氧化劑例如維生素E是脂溶性的,它們需要在肉堿的幫助下,越過線粒體膜的載體才能起到在線粒體內防止氧化和抗自由基損傷的作用;(4)可以激活脂肪酸代謝的關鍵酶,促進脂肪酸代謝,維持ATP的水平和細胞穩定的生理環境;(5)通過防止鐵螯合物的形成捕捉自由基,當初級抗氧化防御屏障不能保證完全消除自由基時,肉堿作為長鏈脂肪酰基的載體,參與膜修復過程中膜磷脂的去酰化-重酰化,有利于膜的及時修復,起到次級抗氧化防御屏障的作用;(6)可以激活線粒體內DNA修復酶,從而促進DNA氧化損傷的修復。

[1]許豪文.肉毒堿的代謝作用在運動實踐中的應用[J].武漢體育學院學報,1991,(2):72-75.

[2]張 薇,陳家琦,陳 雷.L-肉毒堿對足球運動員訓練過程中生理機能的影響研究[J].天津體育學院學報,1998,13(4):22-24.

[3]宋海燕,曾憲惠,劉明旺,等.肉毒堿對實驗性心肌損傷線粒體呼吸酶的影響[J].哈爾濱醫科大學學報,1997,(1):37-38.

[4]Rajasekar P,Anuradha C.V.Fructose-induced hepatic gluconeogenesis:Effect of L-carnitine[J].Life Sci,2007,80(13):1176-1183.

[5]李 潔,王玉俠,張耀斌,等.補充輔酶Q10及遞增負荷跑臺運動訓練對大鼠心肌和腦線粒體電子傳遞鏈酶復合體活性的影響[J].體育科學,2008,28(1):43-48,65.

[6]Vyatkina G,Bhatia V,Gerstner A,et al.Impaired mitochondrial respiratory chain and bioenergetics during chagasic cardiomyopathy development[J].Biochim Biophys Acta,2004,1689(2):162-173.

[7]張庭廷.肉毒堿缺乏與臨床[J].國外醫學·生理、病理科學與臨床分冊,1992,12(1):24-27.

[8]王京鐘,王筱桂.L-左旋肉堿對人體運動能力的影響[J].中國食品添加劑,2003,(5):40-43.

[9]李協群,趙國雄,鄧文革,等.左旋肉堿對競技運動員生理生化的影響及在運動實踐中的應用[J].體育科學,1996,16(4):66-71.

[10]王秋靈.L-肉堿對耐力訓練小鼠力竭運動后氧化應激和能量代謝相關酶的影響[D].華東師范大學碩士學位論文,2006.26-27.