擬柱胞藻檢測(cè)技術(shù)改進(jìn)

莆田市環(huán)境監(jiān)測(cè)站 傅昶寧

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擬柱胞藻檢測(cè)技術(shù)改進(jìn)

莆田市環(huán)境監(jiān)測(cè)站 傅昶寧

近年來，在我國(guó)各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻水華，由于其具有一定的毒性，而且發(fā)生水華時(shí)肉眼不易發(fā)現(xiàn)，同時(shí)爆發(fā)時(shí)，藻密度通常能達(dá)到每升上億個(gè)細(xì)胞。該文根據(jù)與其它藻類不同的特性，提出了擬柱胞藻檢測(cè)方法，通過對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)方法的改進(jìn)，證明了其實(shí)用性、準(zhǔn)確性和簡(jiǎn)潔性。

擬柱胞藻 檢測(cè) 鑒定 改進(jìn)

1 概述

擬柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)，又名拉氏擬柱胞藻，為藍(lán)藻類原核生物念珠藻目念珠藻科柱胞藻屬。由于其在不同的環(huán)境下，形態(tài)變化較大，因此，在我國(guó)有中華尖頭藻和拉氏擬魚腥藻等多個(gè)名稱[1]。擬柱胞藻能夠產(chǎn)生Cylindrospermopsin（CYN）、麻痹性貝毒、類毒素-A等。其中CYN能導(dǎo)致肝腎損害，也有可能致癌，麻痹性貝毒和類毒素-A均為神經(jīng)毒素。據(jù)報(bào)道，在澳大利亞棕櫚島，有149人出現(xiàn)了肝腸炎癥狀，這與被擬柱孢藻所產(chǎn)生毒素污染的飲用水有較大相關(guān)性。擬柱孢藻在溫帶和熱帶地區(qū)的淺水水域（如湖泊、水庫等）生長(zhǎng)良好，一旦形成水華，數(shù)目巨大，如美國(guó)印第安納州發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻的19個(gè)湖泊中，藻密度均達(dá)到每升上億個(gè)細(xì)胞[2]。近年來，在我國(guó)山東、湖北、廣東和云南等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了擬柱胞藻及其水華。

由于擬柱胞藻通常不在水體表面形成明顯的浮膜，根據(jù)近幾年對(duì)莆田市東圳水庫拉氏擬柱胞藻的上百次日常檢定發(fā)現(xiàn)，若待到發(fā)現(xiàn)水體顏色變?yōu)檩^為明顯的黃綠色，則藻密度至少在2×108個(gè)細(xì)胞/升以上。一旦水華爆發(fā)，其藻類數(shù)量將占藻類總數(shù)的98%以上。因此，擬柱胞藻的檢測(cè)方法，在對(duì)水庫、湖泊水質(zhì)的預(yù)警和水質(zhì)評(píng)價(jià)中具有十分重要的意義。

2 擬柱胞藻檢測(cè)現(xiàn)狀

由于擬柱胞藻是發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生毒素的最新藍(lán)藻種類，在國(guó)內(nèi)各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中均未見對(duì)擬柱胞藻的毒素或藻密度做出相關(guān)規(guī)定。在我國(guó)，福建、山東、湖北和云南等地發(fā)現(xiàn)了擬柱胞藻及其水華。本文在深入理解《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第四版增補(bǔ)版）中關(guān)于藻類檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了技術(shù)試驗(yàn)，總結(jié)出鑒定擬柱胞藻并改進(jìn)的快速檢測(cè)方法[3]。下面主要以莆田市東圳水庫的擬柱胞藻檢測(cè)為例進(jìn)行說明。

3 擬柱胞藻檢測(cè)方法及改進(jìn)介紹

3.1 儀器及試劑

奧林巴斯AX31顯微鏡，設(shè)備包括帶指示方框的10×目鏡，10×、20×、40×物鏡；

有機(jī)玻璃采水器；

分液漏斗；

0.1mL微量移液器；

50mL棕色標(biāo)本瓶；

計(jì)數(shù)框：面積為20×20mm、容量為0.1mL，其內(nèi)劃分橫直各10行格，共100個(gè)小方格。

22mm×22mm蓋玻片；

魯哥氏液（Lugols solution）：稱取4g碘及6g碘化鉀，溶于100mL純水中，避光保存。

福爾馬林固定液：將4mL福爾馬林（40%）甲醛和10mL甘油溶于86mL純水中。

3.2 水樣的采集及固定

用有機(jī)玻璃采水器采集100～2000mL水樣（視水中藻密度大小適當(dāng)增減采水量），采樣后及時(shí)加入1%體積的魯哥氏液固定。如需長(zhǎng)期保存，再加入幾毫升福爾馬林固定液，密封保存。

3.3 沉淀和濃縮

由于擬柱胞藻細(xì)胞個(gè)體小，且一旦形成水華，數(shù)目巨大，故根據(jù)藻密度，對(duì)固定后的水樣進(jìn)行不同的處理。

當(dāng)藻密度較低，即每升濃度低于10萬個(gè)細(xì)胞時(shí)，將水樣充分搖勻后，取1000mL在分液漏斗中沉淀，沉淀時(shí)間須滿48小時(shí)。在計(jì)數(shù)時(shí)，取沉淀物約30毫升，定容至50毫升。

當(dāng)擬柱胞藻每升濃度處于10萬～30萬個(gè)細(xì)胞時(shí)，無需沉淀和濃縮，可直接進(jìn)行鑒定。

當(dāng)藻密度大于每升30萬個(gè)細(xì)胞時(shí)，根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行稀釋，并補(bǔ)充適量的魯哥氏液進(jìn)行染色固定。

3.4 擬柱胞藻的鑒定和計(jì)數(shù)

由于擬柱胞藻藻絲不易斷裂，將計(jì)數(shù)樣品充分搖勻后，迅速吸取0.1mL樣品到計(jì)數(shù)框中，蓋上蓋玻片。計(jì)數(shù)框中應(yīng)無氣泡，也無樣品溢出。標(biāo)本制成后，靜置幾分鐘，使藻體沉至框底，再進(jìn)行鏡檢。

3.5 擬柱胞藻的鑒定

擬柱胞藻整條藻絲粗細(xì)均勻，藻絲通常寬2～3微米，長(zhǎng)度變化較大，從10～120微米的都有。形態(tài)上，大部分為直線形，在某些地區(qū)會(huì)發(fā)現(xiàn)有卷曲形的[2]，有時(shí)可見異形胞。在其生長(zhǎng)旺盛期，可見豐富的氣泡。擬柱胞藻的單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度范圍為3～10微米，由于其很少出現(xiàn)細(xì)胞收縮，故單個(gè)細(xì)胞往往很難區(qū)分。

圖1 直線型擬柱胞藻

圖2 卷曲形擬柱胞藻

圖3 直線型擬柱胞藻的異形胞

3.6 擬柱胞藻的計(jì)數(shù)

在東圳水庫，擬柱胞藻爆發(fā)期的藻密度通常在每升兩億個(gè)細(xì)胞以上，為了減少工作量，對(duì)傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行了改進(jìn)。

首先，根據(jù)擬柱胞藻的個(gè)體長(zhǎng)度與細(xì)胞特性，計(jì)數(shù)時(shí)，顯微鏡目鏡使用10倍，物鏡使用20倍，依照目鏡行格法，間隔選取四個(gè)“半行格”（見圖4），先對(duì)藻絲的個(gè)體數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。一個(gè)“半行格”內(nèi)的個(gè)體數(shù)目一般不少于100個(gè)。圖4所示方法有以下三個(gè)好處：第一，在10×20倍放大倍數(shù)下，每個(gè)視野的直徑剛好等于1mm，即等于面積為20×20mm劃分成100方格后，每個(gè)方格邊長(zhǎng)的一半，單次橫向的十格次視野，剛好是1/2行格，較之10×20倍放大倍數(shù)，一次橫向檢測(cè)所計(jì)視野面積大了一倍，大大減少了工作量，加快檢測(cè)速度；第二，擬柱胞藻的藻絲長(zhǎng)度在該放大倍數(shù)下，較為清楚，同時(shí)，由于擬柱胞藻含有豐富的偽空泡，沉淀時(shí)間不足的情況下，藻絲常會(huì)懸浮在水中，常常出現(xiàn)分層現(xiàn)象，故需要在鏡檢計(jì)數(shù)過程中，需要不斷調(diào)整焦距，比起使用10×40倍的放大倍數(shù)，減小了調(diào)整幅度，使計(jì)數(shù)更為輕松快捷，減緩視力疲勞；第三，取不同行格的上下位置計(jì)數(shù)，能夠較為均衡準(zhǔn)確地統(tǒng)計(jì)總數(shù)，使統(tǒng)計(jì)結(jié)果更具代表性和準(zhǔn)確性。

統(tǒng)計(jì)完個(gè)體數(shù)后，轉(zhuǎn)換使用40倍物鏡，隨機(jī)選取若干個(gè)不重復(fù)視野，統(tǒng)計(jì)各視野內(nèi)全部藻絲個(gè)體的細(xì)胞數(shù)和個(gè)體數(shù)，再進(jìn)行換算。一般所參與此處統(tǒng)計(jì)的個(gè)體數(shù)不得少于30條。

由于擬柱胞藻很少出現(xiàn)細(xì)胞收縮，若按照傳統(tǒng)檢測(cè)方法，對(duì)細(xì)胞總數(shù)直接進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，工作量巨大，極大地影響了技術(shù)效率。每個(gè)樣品，各取樣和計(jì)數(shù)兩次，兩次結(jié)果與平均數(shù)之差應(yīng)不大于±15%，否則須繼續(xù)取樣計(jì)數(shù)。

圖4 計(jì)數(shù)板上四個(gè)“半行格”的計(jì)數(shù)方法

3.7 計(jì)算結(jié)果

每升水樣中擬柱胞藻的數(shù)量按下式計(jì)算：

N=A/Ac×Vs/Va·n （1）

根據(jù)以上計(jì)數(shù)方法，一個(gè)計(jì)數(shù)框共含10行格，實(shí)計(jì)數(shù)2行格，在擬柱胞藻密度較高時(shí)，未進(jìn)行稀釋的情況下，則（1）～（2）式可簡(jiǎn)化為：

N=5×104·n （4）

依（3）和（4）式計(jì)算出水樣中的擬柱胞藻含量，并根據(jù)（3）式所得的個(gè)體平均細(xì)胞數(shù)對(duì)水庫水質(zhì)未來幾日發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行簡(jiǎn)單的判定。

3.8 改進(jìn)方法要點(diǎn)

第一，樣品中擬柱胞藻密度較低時(shí)，濃縮沉淀時(shí)間必須滿48小時(shí)。由于新鮮的擬柱胞藻富含偽空泡，固定時(shí)間不足的情況下，會(huì)有較多的細(xì)胞無法沉淀，從而導(dǎo)致濃縮后檢測(cè)結(jié)果偏小。

第二，在計(jì)數(shù)過程中，以計(jì)數(shù)框的四個(gè)“半行格”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不但不需要計(jì)算視野面積，無需配置臺(tái)尺和目尺，而且在充分體現(xiàn)了抽樣大小和代表性的情況下，通過實(shí)測(cè)兩行格的統(tǒng)計(jì)方式，大大減少了工作量，提升了工作效率。

第三，在日常藻類鑒定過程中，大多使用40倍物鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，本文根據(jù)擬柱胞藻的個(gè)體長(zhǎng)度及其在水華爆發(fā)時(shí)期會(huì)導(dǎo)致物種的多樣性和豐富性明顯下降[2]的特性，選擇使用20倍物鏡，不但可以清晰地看出擬柱胞藻的個(gè)體，同時(shí)還能在相同工作量下，增大計(jì)數(shù)面積，增加了統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性和代表性。

第四，在計(jì)數(shù)方法上，不使用常規(guī)的按細(xì)胞計(jì)數(shù)，而是按照個(gè)體計(jì)數(shù)，再用個(gè)體總數(shù)乘以個(gè)體上的平均細(xì)胞數(shù)，來獲得統(tǒng)計(jì)數(shù)值。這樣做，既減少了由于藻細(xì)胞分隔不明顯，需要統(tǒng)計(jì)大量數(shù)值而容易出現(xiàn)的誤差和視覺疲勞，同時(shí)也極大加快了計(jì)數(shù)速度，及時(shí)有效地提供應(yīng)急監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。而且，通過對(duì)個(gè)體上的藻體平均細(xì)胞數(shù)長(zhǎng)期總結(jié)比較，根據(jù)擬柱胞藻的生長(zhǎng)周期，可以在一定程度上對(duì)其未來幾日內(nèi)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行預(yù)報(bào)，為水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)化的預(yù)警提供了可能。

4 結(jié)語

經(jīng)典藻類檢測(cè)方法在用于擬柱胞藻的檢測(cè)時(shí)，非常費(fèi)時(shí)，常常滯后于生產(chǎn)和研究，特別是在爆發(fā)期，極大地影響了對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化問題的分析決策。本方法經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)后，證明了其實(shí)用、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)潔等優(yōu)點(diǎn)，測(cè)試結(jié)果可較為迅速地得出，作為對(duì)擬柱胞藻富營(yíng)養(yǎng)化的水體進(jìn)行的檢測(cè)是高效、可行的。

[1] 查廣才,楊東娟,鄒海鷹.擬柱胞藻的營(yíng)養(yǎng)成分與培養(yǎng)[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,37(8):6-8.

[2] William W. Jones，Sarah Sauter. Distribution and Abundance of Cylindrospermopsis raciborskii in Indiana Lakes and Reservoirs[R]. SPEA-Indiana University，2005，4/5：1-41.

[3] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法（第四版增補(bǔ)版）[M].北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2002.