慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T細胞亞群變化與血清HBV DNA水平分析

王 慰，鄭歡偉，員美娜，任桂芳，李兵順*

（1.河北省石家莊市第五醫院感染二科，河北石家莊050021；2.河北醫科大學公共衛生院流行病與衛生統計學教研室，河北石家莊050017）

慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T細胞亞群變化與血清HBV DNA水平分析

王 慰1，鄭歡偉1，員美娜2，任桂芳1，李兵順1*

（1.河北省石家莊市第五醫院感染二科，河北石家莊050021；2.河北醫科大學公共衛生院流行病與衛生統計學教研室，河北石家莊050017）

目的探討慢性乙型肝炎T細胞亞群與HBV DNA的關系。方法用流式細胞儀直接免疫熒光法測算318例慢性乙型肝炎及22例正常對照者的外周血T細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）百分率，用熒光定量PCR法檢測慢性乙型肝炎HBV DNA，比較不同HBV DNA載量慢性乙型肝炎外周血T細胞亞群的變化。結果慢性乙型肝炎外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比正常對照組降低（P＜0.05）。HBV DNA高載量的慢性乙型肝炎者CD4+T細胞百分率及CD4+/CD8+較低載量者減少（P＜0.05），CD8+T細胞百分率增加（P＜0.05）。結論HBV DNA復制增加可加重慢性乙型肝炎T細胞亞群的紊亂，CD4+/CD8+的動態變化可提示HBV感染者細胞免疫功能的變化。

肝炎，乙型，慢性；病毒；T淋巴細胞

人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）后，可出現不同的臨床轉歸［1-2］。慢性乙型肝炎的發生、發展與機體細胞免疫功能密切相關。慢性乙型肝炎患者HBV DNA載量、肝功能損害程度和體液免疫反應等方面個體差異很大，細胞免疫多數表現為弱T細胞反應。機體免疫反應不足和細胞免疫功能低下導致不能有效清除HBV［3］，從而出現HBV感染慢性化。我們通過檢測HBV感染者外周血T淋巴細胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）及血清HBV DNA載量水平，探討HBV感染后細胞免疫功能的變化及其與血清HBV DNA水平的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：我院2009—2011年就診者的慢性乙型肝炎318例，男性187例，女性131例，年齡18～73歲，平均46.5歲。臨床診斷均符合2000年9月中華醫學會傳染病與寄生蟲學分會、肝病學分會《病毒性肝炎防治方案》［4］中的慢性乙型肝炎診斷標準，且在3個月內未經免疫調節劑及抗病毒治療。正常對照組（非乙型肝炎且無影響T細胞亞群疾患者，如高血壓病、冠心病、糖尿病等）22例，其中男性15例，女性7例，年齡18～60歲，平均49.7歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。具有可比性。

1.2 儀器和試劑：應用美國BECKMAN COULTER公司生產的流式細胞儀，單抗CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5由美國BECKMAN COULTER公司提供。HBV DNA檢測應用美國ABI5700熒光定量PCR檢測儀，試劑由中山醫科大學達安基因股份有限公司提供。

1.3 標本收集：抽取靜脈血6mL分為2管，一管4mL用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，用于流式細胞術檢測，另一管2mL分離血清后用于HBV DNA病毒檢測。

1.4 HBV DNA定量分析：采用熒光定量PCR法，嚴格按照試劑說明書步驟，對患者行HBV DNA檢測（HBV DNA＜0.5U/L為陰性，HBV DNA＞0.5U/L為陽性）。根據HBV DNA載量不同，將CHB患者分為HBV DNA低載量（HBV DNA1～10U/L、平均4.5U/L）與DNA高載量（HBV DNA 10～105U/L、平均5.7×103U/L）2個水平。

1.5 T淋巴細胞亞群檢測：取100 μL抗凝血加入12mm×75mm試管中，加20 μL單抗，室溫避光孵育10min，加溶血素500μL，孵育15min，加稀釋液500μL，10min后上機檢測。比較CHB組HBV DNA陽性、陰性患者與正常對照組CD+、CD+、CD+、CD4+/CD8+的不同；比較不同HBV DNA載量的CHB患者CD+、CD+、CD+、CD+/CD+。

1.6 統計學方法：應用SPSS11.5統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析及q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組外周血T細胞亞群比較：慢性乙型肝炎組患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T淋巴細胞均低于正常對照組（P＜0.05）。慢性乙型肝炎組中，HBV DNA陽性患者CD+、CD+、CD+、

348CD4+/CD8+均較陰性患者升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2組外周血T細胞亞群水平比較（±s）

表1 2組外周血T細胞亞群水平比較（±s）

*P＜0.05與正常對照組比較（q檢驗）

組別例數CD3+（%）CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+正常對照組2273.78±5.4043.60±4.3429.29±5.492.01±0.27慢性乙型肝炎組31866.30±6.20*32.54±6.53*26.60±4.36*1.36±0.75*HBV DNA陰性5565.10±19.30*31.82±10.96*25.50±9.08*1.23±0.83*HBV DNA陽性26369.70±13.40*34.80±12.30*28.20±10.50*1.33±0.72*

2.2 不同HBV DNA載量慢性乙型肝炎陽性患者外周血T細胞亞群比較：與低HBV DNA載量患者相比，高HBV DNA載量慢性乙型肝炎患者CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值減少（P＜0.05），CD8+T細胞升高（P＜0.05），而CD3+T細胞差異無統計學意義。見表2。

表2 不同HBV DNA載量慢性乙型肝炎陽性患者外周血T細胞亞群水平比較（±s）

表2 不同HBV DNA載量慢性乙型肝炎陽性患者外周血T細胞亞群水平比較（±s）

*P＜0.05與低HBV DNA載量比較（q檢驗）

組別例數CD3+（%）CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+低HBV DNA載量9069.15±14.0036.40±13.2028.40±9.731.31±0.77高HBV DNA載量17369.71±9.0735.52±8.95*29.37±5.98*1.28±0.46*

3 討 論

人體感染HBV后，體內抗病毒的免疫反應主要是細胞免疫，而T細胞在特異性免疫應答中起關鍵作用，當T細胞通過有效溶細胞或非溶細胞機制清除病毒，感染便得到控制，反之，病毒則長期存在［5］。

本研究結果表明，慢性乙型肝炎外周血CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群及CD4+/CD8+比值均低于正常對照組。表明慢性乙型肝炎體內細胞免疫功能低下，可能也是T淋巴細胞凋亡增加導致CD3+T細胞數量下降，提示機體參加細胞免疫反應的免疫活性細胞不足。CD4+T細胞生成減少，使特異性抗體產生不足，不能清除游離的HBV，可造成病毒在體內持續存在并影響CD8+T細胞活性［6］。CD8+T數量下降，提示主要是由于輔助性T細胞減少，無法誘導有效的免疫應答以清除病毒。

流行病學調查［7］表明，持續高HBV DNA載量的慢性乙型肝炎患者肝細胞癌發生率增加。提示高HBV DNA水平的患者機體抗病毒及抗腫瘤能力差。在慢性乙型肝炎導致感染者細胞免疫功能改變的同時，HBV DNA的復制活躍進一步加重HBV感染者T細胞亞群紊亂［8］。本研究發現，高HBV DNA載量的慢性乙型肝炎患者CD8+T細胞高于低HBV DNA載量者，提示由于慢性乙型肝炎患者存在不同程度的細胞免疫功能異常，隨著HBV復制增加，高HBV DNA載量會誘發機體免疫耐受，導致免疫應答低下，尤其是影響CD+和CD+T細胞功能。CD+484T細胞對病毒特異性CD8+T細胞的活化是必不可少的。而CD8+T淋巴細胞在控制HBV感染中具有核心作用，在病毒感染過程中，CD8+T細胞最先產生反應，其主要是對病毒抗原肽與主要組織相容性復合體Ⅰ類分子形成的復合物產生應答。本研究表明，隨著HBV復制的增加，高HBV DNA載量者的外周血CD+T細胞以及CD+/CD+減少，而CD+4488T細胞卻增加，說明出現了免疫功能紊亂，免疫應答低下使機體難以清除病毒。而高HBV DNA載量者與低HBV DNA載量者的CD3+T細胞比較差異無統計學意義，可能與人在抗HBV過程中主要是由CD4+和CD8+T細胞直接參與有關。

綜上所述，通過對慢性乙型肝炎外周血T淋巴細胞亞群檢測，可以了解其免疫功能狀態，為臨床觀察提供參考。

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［3］BERTOLETTI A，GEHRING AJ.The immune response during hepatitis B virus infection［J］.J Gen Virol，2006，87（Pt 6）：1439-1449.

［4］中華醫學會傳染病與寄生蟲學分會，肝病學分會.病毒性肝炎防治方案［J］.中華肝臟病雜志，2000，8（6）：324-329.

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（本文編輯：劉斯靜）

R516.6

B

1007-3205（2012）12-1430-03

2012-05-12；

2012-08-03

河北省衛生廳科研基金項目（20090607）

王慰（1976-），女，河北石家莊人，河北省石家莊市第五醫院副主任醫師，醫學學士，從事感染性疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：crb49lbs@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.12.024