四株小鵝瘟病毒的分離與鑒定

中圖分類號：S8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1008—925X（2012）10—0143—01

摘要：近年來養(yǎng)鵝業(yè)與大雁養(yǎng)殖業(yè)均有發(fā)展的趨勢，然而小鵝瘟是一種對雛鵝或者雛大雁危害很大的病毒性傳染病，本實驗室采集臨床上四株疑似小鵝瘟（GP）病例的內(nèi)臟病料分離出四株病毒，進(jìn)行鴨胚致病性試驗，血凝試驗（HA），瓊脂擴(kuò)散試驗（AGP）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等鑒定病毒：結(jié)果表明所分離的毒株為小鵝瘟病毒。

關(guān)鍵詞：小鵝瘟 分離 鑒定

小鵝瘟（Gosling Plague，GP）是由小鵝瘟病毒（Gosling Plague Virus，GPV）引起的雛鵝和雛番鴨的急性或亞急性的敗血性傳染病。本病主要侵害出殼后4～20日齡的雛鵝和雛番鴨，具有傳播快，發(fā)病率和致死率高的特點，死亡率可達(dá)90%～100%。隨著雛鵝日齡增大而發(fā)病率和致死率下降[1]。

1、材料和方法

1.1 材料

病料采自淮安獸醫(yī)站；標(biāo)準(zhǔn)GPV陽性血清，由常州農(nóng)業(yè)水利服務(wù)中心提供；標(biāo)準(zhǔn)GPV陽性抗原，由揚州威克生物有限公司保存；番鴨胚由江蘇某種鴨場提供；非免疫雞胚由揚州某非免疫雞場提供。

1.2方法

1.2.1 樣品處理

將采集的病死鵝的腸道、肝臟、脾臟作為分離樣品，研磨并逐漸加入磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋，制成20%的組織懸液。加入1000IU/ml青霉素、鏈霉素混勻，37℃孵育30分鐘后，再以1000rpm離心5分鐘，取上清，置于—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 番鴨胚接種

用上述接種材料經(jīng)尿囊腔接種12～14日齡的無GPV抗體的易感番鴨胚（0.2ml/枚），置37℃溫箱孵育。24小時觀察，剔除死胚，繼續(xù)孵化。以后每天照胚2～4次，收取孵化過程中死亡的胚，以及接種9天后仍未死亡的胚的尿囊液。同時觀察胚體病變。

1.2.3 HA試驗

在加入50ul PBS的96孔血凝板上的每排第一孔加入50ul收獲的尿囊液，進(jìn)行倍比稀釋，然后加入50ul 1%紅細(xì)胞，混勻，置37度放置15min后觀察結(jié)果。

1.2.4 病毒形態(tài)學(xué)觀察

將收集的尿囊液先在4℃經(jīng)15000rpm離心30min，棄去大部分上清，留離心管底部大約50ul液體，吹勻后，直接置銅網(wǎng)上，吸附5min后，用磷鎢酸負(fù)染2min，負(fù)染后干烤15min，隨后進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.5 瓊脂擴(kuò)散試驗（AGP）

玫瑰花環(huán)式打孔，兩孔之間間距為5mm。用打孔器打孔后，用針頭將孔內(nèi)瓊脂挑出，不要劃破邊緣，將平皿底在酒精燈上燒一下，以不燙手為準(zhǔn)，封底，中間孔加標(biāo)準(zhǔn)GPV的陽性血清，1，4孔加標(biāo)準(zhǔn)GPV的陽性抗原，其余孔加待檢尿囊液。并作好一一對應(yīng)記錄。

1.2.6 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

將尿囊液1000rpm離心5分鐘后取上清，用終濃度100？g蛋白酶K和終濃度為30iu/ml的Rnase對尿囊液進(jìn)行消化。56℃ 6小時或37℃過夜后，用苯酚、氯仿抽提去脂，去蛋白，用50ul 超純水溶解，用于PCR。

1.2.7 雞胚接種

用上述無菌采集的尿囊液在雞胚上盲傳三代，以0.2ml/枚經(jīng)尿囊腔接種9～11日齡的雞胚，置37℃溫箱孵育。24小時觀察，剔除死胚，繼續(xù)孵化。以后每天照胚2次，收取孵化過程中死亡的胚，以及接種120小時后仍未死亡的胚的尿囊液。按1.2.3的方法測HA。

1.2.8 SY1003毒株對番鴨胚的半數(shù)致死量（ELD50）的測定

將SY1003—M2的尿囊液以10—1、10—2、10—3、10—4、10—5、10—6稀釋后分別接種12～14日齡的無GPV抗體的易感番鴨胚經(jīng)尿囊腔接種（0.2ml/枚），置37℃溫箱孵育。24小時觀察，剔除死胚，繼續(xù)孵化。以后每天照胚2～4次，收取孵化過程中死亡的胚，以及接種216小時后仍未死亡的胚的尿囊液。同時觀察胚體病變。最后統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2、結(jié)果

2.1臨床癥狀

主要表現(xiàn)為呼吸癥狀，拉白痢，縮頭呆立，有些鵝臨死前出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，角弓反張。

2.2 病理變化

腸壁變薄，有光滑腸內(nèi)容物與纖維炎性滲出物凝固形成堵塞物，即腸腔的栓子（灰褐色），十二指腸臌氣，喉頭有大量黏液。

2.3 分離病毒

所采集的病料接種番鴨胚均能引起死亡鴨胚絨毛尿囊膜增厚，胚體充血、出血，出血部尤以頭后部，頸部明顯，肝臟、腎臟出血、腫大。并能導(dǎo)致番鴨胚死亡，且均無血凝性，將此病毒分別命名為HA1003、CZ1003、SY1003、LS1003。

2.4 分離株病毒的形態(tài)特征

為了確定分離病毒是否是小鵝瘟病毒，我們將SY1003—M2株病毒番鴨胚尿囊液粗提物進(jìn)行負(fù)染透射電鏡觀察，結(jié)果觀察到球形，無囊膜，直徑約為20nm的病毒樣粒子。

2.5 AGP結(jié)果

HA1003—M2—1，HA1003—M2—2有明顯的沉淀線，其它毒株無沉淀線。

2.6 PCR結(jié)果

PCR擴(kuò)增后，用GPV特異的引物能夠特異性地對組織臟器懸液上清中的GPV擴(kuò)增出約為0.7kb核苷酸片段。

1. 以LS1003株的病變胚體的組織DNA為模板，沒有條帶

2. 以CZ1003株產(chǎn)物的病變胚體的組織DNA為模板，約為0.7kb

3. 以HA1003株產(chǎn)物的病變胚體的組織DNA為模板，約為0.7kb

4. 以SY1003株產(chǎn)物的病變胚體的組織DNA為模板，約為0.7kb

3、小結(jié)與討論

3.1本研究從臨床上采集的四個疑似小鵝瘟的病料，經(jīng)過接種無GPV抗體的易感番鴨胚，分離到四株毒株，其中鑒定為小鵝瘟病毒的毒株有三株，分別命名為CZ1003、HA1003、SY1003在這四株毒株中無共感染病例，分離率達(dá)75%。

3.2 我們通過對特征性病料的番鴨胚接種分離與傳代，胚體病變基本相同：尿囊膜增厚，胚體全身出血，尤以頸部和腦后出血嚴(yán)重，胚肝，胚腎均出血嚴(yán)重，且有腫大。

3.3 我們曾用從揚州某炕坊購買的鵝胚分離，但效果不佳，胚體有病變，但胚不死亡，而用番鴨胚分離的效果較好，這可能是由于在鵝胚中普遍存在母源抗體。

3.4 目前，對禽細(xì)小病毒（Avian parvovirus）的診斷除了根據(jù)臨床與病理學(xué)特征外，實驗室常規(guī)診斷主要采用針對抗體的血清學(xué)方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]江美娟，董國雄，方定一.鴨胚化小鵝瘟弱毒疫苗的培育及初步測定[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1984，5（1）：63～63.

[2]何海蓉，季明，朱國強(qiáng)，等.番鴨細(xì)小病毒瓊擴(kuò)抗原研制及初步應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2000 ， 1 ： 59—60

[3]胡奇林，程由銼，陳少鶯，等.四種檢測番鴨細(xì)小病毒抗原方法的比較[J].福建畜牧獸醫(yī)，2000， 2： 4—6