轉錄因子Ｓｐ１對成肌細胞中豬ＳＫＩＰ的表達調控作用

熊琪 柴進 張年 索效軍 李曉鋒 楊前平 劉洋 陳明新

摘要：利用基因組ＰＣＲ步移方法獲得豬ＳＫＩＰ轉錄起始位點上游２ ０７５ ｂｐ啟動子序列。生物信息學分析發現該序列中存在４個Ｓｐ１結合位點和１個ＣｐＧ島。將啟動子序列構建到ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ的雙熒光素酶報告基因載體上，再利用ＲＮＡ干擾技術分析轉錄因子Ｓｐ１對ＳＫＩＰ轉錄的影響。熒光素酶活性分析發現Ｓｐ１的表達抑制使成肌細胞中ＳＫＩＰ啟動子活性顯著下降，表明轉錄因子Ｓｐ１可能通過順式作用元件ＧＣ－Bｏｘ對成肌細胞分化過程中ＳＫＩＰ基因的轉錄激活起正向調控作用。

關鍵詞：Ｓｐ１；豬；ＳＫＩＰ；啟動子活性；ＲＮＡ干擾

中圖分類號：Ｑ７８９文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）18－4147-05

Role of Transcription Factors Sp1 in the Expressional Regulation of SKIP Gene in Porcine C2C12 Myoblasts

ＸＩＯＮＧ Ｑｉ１，ＣＨＡＩ Ｊｉｎ２，ＺＨＡＮＧ Ｎｉａｎ１，ＳＵＯ Ｘｉａｏ－ｊｕｎ１，ＬＩ Ｘｉａｏ－ｆｅｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｑｉａｎ－ｐｉｎｇ１，ＬＩＵ Ｙａｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｍｉｎｇ－ｘｉｎ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ／Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｇｅｎｏｍｅ ｗａｌｋｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｌｏｎｅ ｔｈｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ＳＫＩＰ． Ａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ２ ０７５ ｂｐ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｈａｄ ４ Ｓｐ１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｏｎｅ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ． Tｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ＳＫＩＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｐ１ ｏｎ ＳＫＩＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ＲＮＡｉ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ａ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｉｎ ＳＫＩＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ through ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｓｐ１ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｃ２Ｃ１２ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｓｐ１ ｐｌａｙｅｄ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ＳＫＩＰ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｏｓｓｉｂｌｙ ｂｙ ＧＣ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｙｏｔｕｂｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｐ１； ｐｏｒｃｉｎｅ； ＳＫＩＰ； ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ＲＮＡｉ interference

骨骼肌纖維是骨骼肌的主要組成部分，肌纖維的數量和大小直接影響家畜的胴體性狀，與遺傳因素相關。５′肌醇磷酸酶（ＳＫＩＰ）由Ｉｊｕｉｎ等［１］首先發現并分離，在各組織中廣泛表達，尤其在心臟、骨骼肌和腎臟中高表達，因此ＳＫＩＰ被稱為骨骼肌和腎臟富含的５′肌醇磷酸酶。通過人與豬比較圖譜，發現豬的ＳＫＩＰ定位在豬１２號染色體ＳＳＣ１２ｑ１．３上。其所在位置存在影響第１０肋骨背膘厚、胴體長［２］、肌纖維數量［３］和大腿重［４］的ＱＴＬ區域。運用牛基因圖譜信息，發現牛ＳＫＩＰ定位在１９號染色體 ＢＴＡ１９ｑ１．３上，其所在位置存在影響犢牛出生重［５］的ＱＴＬ區域。ＳＫＩＰ雜合突變小鼠比目魚肌和股四頭肌的重量顯著提高［６］也印證ＳＫＩＰ具有調節骨骼肌纖維發育的功能。因此有必要進一步研究該基因參與骨骼肌生長發育的表達調控機制，為弄清楚肌纖維的生長發育規律奠定基礎。

１材料與方法

１．１材料

限制性內切酶、Ｔ４連接酶、反轉錄試劑盒等購自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ－ＭＢＩ公司；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ分子質量標準ＤＬ ２０００、ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ載體等購自全式金生物公司；染色體步移試劑盒購自Ｃｌｏｔｅｃｈ公司；雙熒光素酶報告系統檢測試劑盒購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。

１．２步移引物設計和ＰＣＲ擴增

根據豬ＳＫＩＰ第一外顯子序列， 采用Ｐｒｉｍｅｒ ５．０設計步移巢式引物，如表１，引物由北京奧科生物技術有限公司合成。步移擴增由兩輪ＰＣＲ反應組成。第一輪ＰＣＲ反應體積為５０ μＬ，反應體系為 ５ μＬ １０×Ｂｕｆｆｅｒ，１ μＬ ｄＮＴＰ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ），１ μＬ引物ＡＰ１和第一輪ＰＣＲ特異引物，１ μＬ文庫ＤＮＡ模版，去離子水補足至５０ μＬ，離心混勻。第一輪ＰＣＲ反應條件為：９４℃ ５ ｍｉｎ 后迅速加入Ｔａｑ酶１ μＬ； ９４ ℃ ２５ ｓ，７２ ℃ ３ ｍｉｎ ，７個循環；然后９４ ℃ ２５ ｓ，６７ ℃ ３ ｍｉｎ ，３２ 個循環； ６７ ℃ ７ ｍｉｎ。取５ μＬ 第一輪ＰＣＲ產物，在１．５％的瓊脂糖中電泳檢測。確認后繼續第二輪ＰＣＲ 反應。除了模板、引物改變外，第二輪ＰＣＲ 反應體系與第一輪相同。將１ μＬ第一輪ＰＣＲ產物（包括陽性和陰性對照）稀釋５０倍，取其中１ μＬ作為第二輪ＰＣＲ反應的模板，引物為ＡＰ２ 和第二輪ＰＣＲ特異引物。第二輪ＰＣＲ反應條件為： ９４ ℃預變性１０ ｍｉｎ；９４ ℃變性２５ ｓ，７２ ℃ ３ ｍｉｎ ，５個循環； ９４ ℃變性２５ ｓ，６２ ℃ ３ ｍｉｎ，２０個循環； ６７ ℃延伸７ ｍｉｎ。取５ μＬ產物，在１．５％的瓊脂糖凝膠中電泳。

１．３生物信息學分析

在線網站ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄｂ／ＴＦＳＥＡＲＣＨ．ｈｔｍｌ分析基因啟動子區的轉錄因子結合元件，ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ／ｉｎｄｅｘ１．ｈｔｍｌ）預測基因啟動子區是否有ＣｐＧ島。

１．４豬ＳＫＩＰ啟動子表達載體的構建

根據ｐＧＬ３－ｂａｓｉｃ 載體的多克隆位點和豬ＳＫＩＰ的啟動子序列，設計包含ＳａｃⅠ酶切位點的正向引物Ｐ１Ｆ：５′-ＡＡＡＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＧＧＣＴＴ

ＧＡ-３′和ＸｈｏⅠ酶切位點的反向引物ＰＲ：５′-ＣＣＣＴＣ

ＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＧＧＴＴＣＧＧＴＣＴ-３′，以豬基因組ＤＮＡ為模板進行ＰＣＲ擴增。直接將符合目的片段大小的ＰＣＲ產物用限制性內切酶ＳａｃⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切，３７ ℃過夜。將ＳａｃⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切的線性化ｐＧＬ３－Bａｓｉｃ載體與目的片段按照１∶３摩爾比均勻混合，用Ｔ４連接酶連接，然后轉化大腸桿菌ＤＨ５α。

１．５化學合成Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡｓ

根據在線軟件 ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／ｄｅｓｉｇｎ．ｄｏ 設計化學合成的ｓｉＲＮＡ靶序列，見表２。

１．５實時定量ＰＣＲ

在Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡｓ轉染Ｃ２Ｃ１２細胞６ ｈ后用２％馬血清誘導細胞分化，于分化第三天提取細胞ＲＮＡ。

ＰＣＲ反應體系：ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２．５ μＬ，定量引物０．５ μｍｏｌ／Ｌ， ｃＤＮＡ模板 ５００ ｎｇ，補去離子水至總體積為２５ μＬ。ＰＣＲ擴增程序：９５ ℃預變性２ ｍｉｎ；９４ ℃變性２０ ｓ，５８ ℃退火２０ ｓ，７２ ℃延伸３５ ｓ，７４ ℃讀板， ４０個循環，每個樣３個重復。ＰＣＲ反應的特異性通過產物溶解曲線確認。用ＢｉｏＲａｄ公司的ｉＱ５軟件分析結果。先將閾值選定在各對數擴增曲線平行上升的最低點，得到各管的Ｃｔ值。軟件會算出每個基因Ｃｔ值的平均數及標準差和每組特異基因相對于內參的表達量。應用SPSS １３．０軟件的單因素方差方法分析不同處理組中基因的表達是否具有顯著差異，Ｐ＜０．０５為具有顯著性差異。

１．６啟動子的熒光素酶活性分析

在重組載體和Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡ共轉染Ｃ２Ｃ１２細胞２４ ｈ后，小心吸棄培養基， ＰＢＳ洗２次。２００ μＬ／孔的Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ滴加到２４孔板的每孔細胞中，在室溫避光裂解１５ ｍｉｎ。置振蕩器振蕩３０ ｓ，將裂解完全的細胞裂解液收集到１．５ ｍＬ ＥＰ管中，－８０ ℃貯存備用。檢測前先在室溫中平衡細胞裂解混合液，每個樣品取１０ μＬ到黑色９６孔酶標板中搖勻，使細胞裂解液均勻鋪滿底部。提前３０ ｍｉｎ預熱報告基因檢測儀。將樣品、工作液依次放入到檢測儀器內，設置好程序后開始檢測，每個樣品將會有２個熒光素酶報告值Ａ和Ｂ，Ａ值與Ｂ值的比值就是每個樣品的相對表達量。

２結果與分析

２．１豬ＳＫＩＰ啟動子的克隆

根據豬ＳＫＩＰ第一外顯子序列，設計２條特異的ＰＣＲ引物，分別為ＦＧＰＳ１和ＦＧＰＳ２。以４個不同酶切的基因組步移庫為模板，以ＦＧＰＳ１和ＡＰ１（Ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ １）配對進行第一輪ＰＣＲ反應。將第一輪ＰＣＲ反應產物用去離子水稀釋50倍后作為第二輪ＰＣＲ反應的模板，將引物ＦＧＰＳ２與ＡＰ２（Ｎｅｓｔｅｄ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉｍｅｒ ２）組合進行第二輪ＰＣＲ擴增。擴增結果電泳檢測，第一輪ＰＣＲ反應的產物均呈彌散帶（圖１－Ａ）；第二輪ＰＣＲ產物中，經ＰｖｕⅡ消化后的基因組為模板擴增出大小約３２８ ｂｐ的片段，電泳檢測結果如圖１－Ｂ所示。

根據第一次ＰＣＲ步移得到ＳＫＩＰ啟動子序列，設計了另一對嵌套特異引物ＳＧＰＳ１和ＳＧＰＳ２對ＳＫＩＰ進行第二次步移。同樣以４個不同酶切的基因組步移庫為模板，引物ＳＧＰＳ１與ＡＰ１組合進行第一輪ＰＣＲ擴增（圖２－Ａ），以ＳＧＰＳ２和ＡＰ２為巢式引物進行第二輪ＰＣＲ擴增（圖２－Ｂ）。在第二輪ＰＣＲ產物中，經ＤｒａⅠ消化后的基因組為模板擴增出大小約８７１ ｂｐ的片段（泳道４）。

鑒于擴增片段長度偏短，再根據第二次ＰＣＲ步移得到ＳＫＩＰ啟動子序列，又設計了一對嵌套特異引物ＴＧＰＳ１和ＴＧＰＳ２對ＳＫＩＰ進行第三次步移。 繼續以四個不同酶切的基因組步移庫為模板，引物ＴＧＰＳ１與ＡＰ１組合進行第一輪ＰＣＲ擴增（圖３－Ａ），以ＴＧＰＳ２和ＡＰ２為巢式引物進行第二輪ＰＣＲ擴增（圖３－Ｂ）。在第二輪ＰＣＲ產物中，經ＥｃｏＲ Ｖ消化后的基因組為模板擴增出約１ １８２ｂｐ的片段（泳道４）。將３次基因組步移所得到的序列拼接起來，得到豬ＳＫＩＰ部分啟動子序列。

２．２啟動子序列分析

將３次基因組步移拼接得到的豬ＳＫＩＰ啟動子區序列利用在線軟件ＴＦＳＥＡＲＣＨ預測分析啟動子中的潛在順式作用元件，發現３個潛在的ＴＡＴＡ ｂｏｘ，２個ＭｙｏＤ結合位點，４個Ｓｐ１結合位點和１個位于起始密碼子上游的ＣｐＧ島，如圖４所示，而４個Ｓｐ１結合位點都處于ＣｐＧ島中。為了闡明ＳＫＩＰ的表達調控機制，將２ ０７５ ｂｐ的啟動子序列片段（－２ ０３８到＋３７）克隆到ｐＧＬ３載體中命名為Ｐ１，酶切鑒定如圖５。

２．３Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡ的合成和干擾效果

為了深入了解Ｓｐ１對肌細胞分化過程中ＳＫＩＰ轉錄的影響，用化學合成的方法合成Ｓｐ１的干擾序列Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡｓ，化學合成的Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡｓ轉染分化中的肌細胞的實時定量分析如圖６所示。

實時定量ＰＣＲ結果顯示，Ｓｐ１和β－ａｃｔｉｎ標準曲線制備均在線性范圍內，擴增產物溶解曲線符合要求。Ｓｐ１的ｍＲＮＡ表達量在各試驗組及對照組中整體水平差異顯著（Ｐ＜０．０５）。３個Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡ在肌細胞中均抑制Ｓｐ１的表達，其中Ｓｐ１－ｓｉＲＮＡ２抑制率最高。

２．４Ｓｐ2-ｓｉＲＮＡ２表達抑制對肌細胞分化和ＳＫＩＰ啟動子活性的影響

由圖7可知，Ｓｐ2－ｓｉＲＮＡ２顯著降低了ＭＨＣ和ＴｎＴ的表達，抑制了肌細胞的終末分化。利用Ｓｐ１-ｓｉＲＮＡ２與啟動子Ｐ１共轉染肌細胞分析Ｓｐ１對肌細胞中ＳＫＩＰ表達的影響。熒光素酶活性分析表明Ｓｐ１受到干擾時，ＳＫＩＰ啟動子的活性也顯著下降了（圖８）。表明轉錄因子Ｓｐ１可能通過順式作用元件ＧＣ－Bｏｘ對肌肉細胞分化過程中ＳＫＩＰ的轉錄激活起正向調控作用。

３討論

有研究發現，脊椎動物基因組包含未甲基化的ＣｐＧ島［７］。雖然不清楚這些區域是怎么維持非甲基化狀態的，但是在有些情況下這依賴于轉錄因子Ｓｐ１的結合［８］。Ｓｐ１是較早克隆和鑒定出的結合在ＳＶ４０啟動子上的真核轉錄因子［９］。它包含３個鋅指結構基序，Ｃｙｓ-２-Ｈｉｓ-２，能結合在ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ序列上［１０］。Ｓｐ１結合位點經常在ＣｐＧ島區出現。有研究發現Ｓｐ１結合位點對維持ＡＰＲＴ基因ＣｐＧ島的非甲基化狀態十分關鍵［１１］。預測發現位于轉錄起始位點上游的１個ＣｐＧ島區域和若干Ｓｐ１結合位點，推測Ｓｐ１轉錄因子可能是調節ＳＫＩＰ穩定表達的潛在轉錄因子。如果沒有Ｓｐ１結合位點遍布ＣｐＧ島區，則ＳＫＩＰ啟動子很容易被甲基化引起轉錄活性的抑制，但是５′肌醇磷酸酶ＳＫＩＰ是廣泛表達且在某些組織是高表達的，暗示轉錄因子Ｓｐ１可能避免基因組ＣｐＧ島被甲基化。通過Ｓｐ１ ＲＮＡ干擾分析Ｐ１啟動子在肌細胞的活性，發現ＳＫＩＰ的啟動子活性確實受細胞內Ｓｐ１表達水平的調節，Ｓｐ１轉錄因子的表達抑制顯著地降低了ＳＫＩＰ的活性，可見反式作用因子Ｓｐ１對ＳＫＩＰ的穩定表達至關重要。

Ｓｐ１以豐富的核蛋白形式存在于大多數細胞中，但是在不同的發育階段和不同類型的細胞中，表達水平是有差異的［１２］。Ｓｐ１對ＭｙｏＤ轉錄因子家族的轉錄活性和肌肉細胞的分化也有影響，有研究發現ｐＲｂ、ＭＤＭ２和Ｓｐ１協同調節肌肉細胞的分化［１３，１４］。Ｓｐ１的轉錄活性受到與ＭＤＭ２蛋白互作的影響，Ｓｐ１與ＭＤＭ２的結合抑制了Ｓｐ１與肌肉特異表達基因啟動子ＤＮＡ序列的結合，而當Ｓｐ１與ＭＤＭ２的結合受到ｐＲｂ競爭抑制時，Ｓｐ１從Ｓｐ１－ ＭＤＭ２蛋白復合體中釋放出來，重新結合順式作用元件與ＭｙｏＤ轉錄因子家族成員共同激活肌肉特異表達基因的轉錄，促進肌肉細胞的分化。研究發現干擾Ｓｐ１的表達影響肌細胞的終末分化，進一步證實Ｓｐ１對成肌分化的重要作用以及ＳＫＩＰ可能參與骨骼肌細胞分化進程。

參考文獻：

［１］ ＩＪＵＩＮ Ｔ， ＭＯＣＨＩＺＵＫＩ Ｙ， ＦＵＫＡＭＩ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ５－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，２７５（１５）：１０８７０－１０８７５．

［２］ ＴＨＯＭＳＥＮ Ｈ， ＬＥＥ Ｈ Ｋ， ＲＯＴＨＳＣＨＩＬＤ Ｍ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ｆｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｅａｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ａ ｃｒｏｓｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｂｒｅｅｄｓ ｏｆ ｓｗｉｎｅ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，８２（８）：２２１３－２２２８．

［３］ ＷＩＭＭＥＲＳ Ｋ，ＦＩＥＤＬＥＲ Ｉ， ＨＡＲＤＧＥ Ｔ， ｅｔ ａｌ． ＱＴＬ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｐｉｇｓ［Ｊ］． Ｂｍｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００６，７（1）：１－１５．

［４］ ＭＩＬＡＮ Ｄ， ＢＩＤＡＮＥＬ Ｊ Ｐ， ＩＡＮＮＵＣＣＥＬＬＩ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ｆｏｒ ｃａｒｃａｓｓ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｔｒａｉｔｓ ｉｎ ｐｉｇｓ ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，２００２，３４（６）：７０５－７２８．

［５］ ＴＨＯＭＡＳＥＮ Ｊ Ｒ， ＧＵＬＤＢＲＡＮＤＴＳＥＮ Ｂ， ＳＯＲＥＮＳＥＮ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｃａｌｖｉｎｇ ｔｒａｉｔｓ ｉｎ Ｄａｎｉｓｈ Ｈｏｌｓｔｅｉｎ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］． Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ，２００８，９１（５）：２０９８－２１０５．

［６］ ＩＪＵＩＮ Ｔ， ＹＵ Ｙ Ｅ， ＭＩＺＵＴＡＮＩ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ＳＫＩＰ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１７）：５１８４－５１９５．

［７］ ＣＲＯＳＳ Ｓ Ｈ，ＢＩＲＤ Ａ Ｐ． ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ，１９９５，５（３）：３０９－３１４．

［８］ ＭＡＣＬＥＯＤ Ｄ， ＣＨＡＲＬＴＯＮ Ｊ， ＭＵＬＬＩＮＳ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｓｐ１ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ａｐｒｔ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１９９４，８（１９）：２２８２－２２９２．

［９］ ＤＹＮＡＮ Ｗ Ｓ， ＴＪＩＡＮ Ｒ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ，１９８３，３２（３）：６６９－６８０．

［１０］ ＬＥＴＯＶＳＫＹ Ｊ， ＤＹＮＡＮ Ｗ Ｓ． Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｓｐ１ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＧＣ ｂｏｘ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８９，１７（７）：２６３９－２６５３．

［１１］ ＢＲＡＮＤＥＩＳ Ｍ， ＦＲＡＮＫ Ｄ， ＫＥＳＨＥＴ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｓｐ１ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ ｆｒｏｍ ｄｅ ｎｏｖｏ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７１（６４９６）： ４３５－４３８．

［１２］ ＳＡＦＦＥＲ Ｊ Ｄ， ＪＡＣＫＳＯＮ Ｓ Ｐ， ＡＮＮＡＲＥＬＬＡ Ｍ Ｂ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｐ１ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９１，１１（４）：２１８９－２１９９．

［１３］ ＧＵＯ Ｃ Ｓ， ＤＥＧＮＩＮ Ｃ， ＦＩＤＤＬＥＲ Ｔ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｙｏＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ＭＤＭ２， ｐＲｂ，ａｎｄ Ｓｐ１［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，２７８（２５）：２２６１５－２２６２２．

［１４］ ＡＲＩＺＡ Ｆ， ＨＡＲＲＩＳＯＮ Ｂ， ＤＲＩＮＫＷＡＴＥＲ Ｒ Ｄ． Ｔｈｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｂｙ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｆｏｕｒ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２２ ｔｏ ｂｏｖｉｎｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ５ ａｎｄ １７［Ｊ］． Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，３２（６）：３７１－３７４．

收稿日期：２０１２－０６－１４

基金項目：湖北省動物胚胎工程及分子育種重點實驗室開放課題（２０１０ＺＤ１１１）；湖北省科技計劃自然科學基金重點項目（２０１０ＣＢＢ０１３０１）；

湖北省農業科學院青年科學基金（２０１１ＮＫＹＪＪ１６）；華中農業大學自主創新基金（２０１０ＢＱ００１）；華中農業大學青年教師科技創新項目

（２０１１ＱＣ００１）；湖北省農業科技創新中心（２０１１－６２０－００１－００３）

作者簡介：熊琪（１９８１－），女，湖北武漢人，助理研究員，博士，主要從事草食家畜的分子育種研究工作，（電話）１３０７２７１６７７２（電子信箱）

ｘｑ１２２３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；通訊作者，陳明新，研究員，（電子信箱）ｘｉｏｎｇｑｉ＠ｗｅｂｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。