ca²⁺濃度對羅氏沼蝦Gq蛋白α亞基亞細胞定位的影響

馮志國 劉慧娟

摘要：采用免疫膠體金電鏡技術研究光暗適應條件下不同Ｃａ２＋濃度對羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergi）感光細胞中Ｇｑ蛋白α亞基亞細胞定位的影響。結果表明，對于光適應組，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中細胞質與感桿束中膠體金密度的比值是３．５１、２．１３和０．９３。對于暗適應組，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中細胞質與感桿束中膠體金密度的比值是３．０１、１．０８和０．４７。這些表明了羅氏沼蝦感光細胞中Ｇｑ蛋白α亞基在暗適應條件下同時分配在感桿束和細胞質中。在光照和細胞質內Ｃａ２＋濃度適度升高的條件下，膜結合的Ｇｑ蛋白α亞基進而轉化為可溶性的Ｇｑ蛋白α亞基。

關鍵詞：羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergi）；感光細胞；Ｇｑ蛋白；Ｃａ２＋；免疫膠體金電鏡

中圖分類號：Ｑ９５９．２２３＋６３；Ｒ４４６．６１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）18－4141-03

Effects of Ca2+ Concentration on Subcellular Localization of Gq Protein α Subunit in Macrobrachium rosenbergi

ＦＥＮＧ Ｚｈｉ－ｇｕｏ，ＬＩＵ Ｈｕｉ－ｊｕａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉｎｙａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｙａｎｇ ４６４０００，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ ｏｆ Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ ｗｉｔｈ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｄａｒｋ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｈｅ ｇｏｌｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｒｈａｂｄｏｍ ｔｏ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｉｎ Ｍ． ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎ ｈｉｇｈ Ｃａ２＋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｗ Ｃａ２＋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ３．５１， ２．１３ ａｎｄ ０．９３， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｈｉｇｈ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｗ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ３．０１， １．０８ ａｎｄ ０．４７， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ Ｇｑ pｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｏｔｈ ｏｎ ｔｈｅ ｒｈａｂｄｏｍ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｉｎ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ ｏｆ Ｍ． ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ ｕｎｄｅｒ ｄａｒｋ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｈｉｇｈ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ； ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ； Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｃａ２＋； ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ

免疫膠體金電鏡是研究生物大分子在亞細胞水平的定位、進一步探討大分子功能的最重要技術之一，ＩｇＧ具有雙價性，它的一臂可結合到事先包被有抗原的膠體金上，也可以把抗體分子包被在膠體金上對細胞內的抗原進行定位。該技術首先用膠體金顆粒對抗原的抗體進行標記，然后用標記抗體對組織超薄切片進行免疫反應，有抗原存在的細胞結構即被膠體金顆粒標記，在電鏡下根據膠體金顆粒的分布情況及密度即可確定抗原的亞細胞分布及相對含量。近年來膠體金探針己成為定位和分析多種蛋白質、多肽、多糖的有力工具，特別是在抗原酶及激素等物質的細胞免疫化學定位中更加顯示了其獨特的作用。

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergi）感光細胞中Ｇｑ蛋白α亞基有可溶性和膜結合兩種形式［１，２］，Ｇｑ蛋白α亞基在光感覺生理中的作用不僅取決于不同形式Ｇｑ蛋白α亞基含量的變化，而且與其在細胞內的分布密切相關［３－５］。采用生理生化的方法能測定不同形式Ｇｑ蛋白α亞基的含量，而采用免疫定位可以反映其細胞及亞細胞分布變化。采用免疫膠體金電鏡技術研究光暗適應條件下不同Ｃａ２＋濃度對羅氏沼蝦感光細胞中Ｇｑ蛋白α亞基的影響，以期從亞細胞水平揭示Ｃａ２＋與Ｇｑ蛋白α亞基之間的關系，為闡明Ｇｑ蛋白α亞基的作用機制及Ｃａ２＋在光感覺生理中的作用打下基礎。

１材料與方法

１．１材料

羅氏沼蝦購買于上海市漕河涇農貿市場，試劑、藥品均為進口分裝或國產分析純。兔抗Ｇｑ蛋白α亞基的抗血清Ｃ端序列（ＩＭＹＳＨＬＶＤＹＦＰＥＹＤＧＰＱＲ）購買于美國Ｂｉｏｄｓｉｇｎ公司。

１．２方法

１．２．１樣品的處理將購買來的１２只羅氏沼蝦隨機平均分成２組飼養在河水中，一組于自然光下飼養６ ｈ后在自然光下解剖復眼，另一組于全暗的環境中飼養６ ｈ后在微弱的紅光下解剖復眼。獲取視網膜并放入孵育杯待用。將活的視網膜分別放入配制的生理溶液、高Ｃａ２＋溶液和低Ｃａ２＋溶液中。將兩組樣品（暗處理組的樣品用遮光紙包住）都放在４ ℃下孵育２４ ｈ。

１．２．２樣品的超薄切片取視紫紅質部分迅速放入固定液（４０ ｇ／Ｌ多聚甲醛和體積分數為０．５％的戊二醛）中，于４ ℃過夜。另一組在微弱的紅光下取視紫紅質部分迅速放入固定液中，于４ ℃過夜。用磷酸鹽緩沖液和含有０．３ ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸的磷酸鹽緩沖液分別清洗樣品，然后用乙醇和丙酮脫水。用Ｅｐｏｎ８１２樹脂包埋、聚合后，再把切好的超薄切片收集在鎳鉻網面上。

１．２．３樣品的免疫標記和電鏡觀察將鎳鉻網面向下漂浮在含體積分數為1％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００的磷酸鹽緩沖液液滴上孵育３０ ｍｉｎ，轉移鎳鉻網到封閉液液滴表面上孵育１ ｈ，轉移鎳鉻網到一抗液滴表面上，于４ ℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液輕洗鎳鉻網面３次，每次５ ｍｉｎ，轉移鎳鉻網到交聯膠體金顆粒的二抗液滴表面上孵育１ ｈ。用磷酸鹽緩沖液輕洗鎳鉻網面３次，每次５ ｍｉｎ，在室溫下轉移鎳鉻網到含體積分數為１％戊二醛的磷酸鹽緩沖液液滴上固定３０ ｍｉｎ，用磷酸鹽緩沖液清洗鎳鉻網面３次，每次３ ｍｉｎ，用去離子水清洗鎳鉻網面３次，每次３ ｍｉｎ。用醋酸鈾及檸檬酸鉛染色，于７５ ｋＶ下用ＨＩＴＡＣＨＩＨ－６００透射電鏡觀察、拍照。

２結果與分析

由表１可知，對于光適應組，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中細胞質與感桿束中膠體金顆粒密度的比值是３．５１、２．１３和０．９３。對于暗適應組，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中細胞質與感桿束中膠體金顆粒密度的比值是３．０１、１．０８和０．４７。由圖1和表1可知，羅氏沼蝦感光細胞中Ｇｑ蛋白α亞基在暗適應條件下同時分配到感桿束和細胞質中。在光照和細胞質內Ｃａ２＋濃度適度升高的條件下，膜結合的Ｇｑ蛋白α亞基進而轉化為可溶性的Ｇｑ蛋白α亞基。

３小結與討論

羅氏沼蝦感光細胞中Ｇｑ蛋白α亞基在暗適應條件下同時分配到感桿束和細胞質中。在光照和細胞質內Ｃａ２＋濃度適度升高的條件下，膜結合的Ｇｑ蛋白α亞基進而轉化為可溶性的Ｇｑ蛋白α亞基。Ｇｑ蛋白α亞基亞細胞定位的變化是去十六酞化物的作用所導致的［５］。

免疫膠體金電鏡技術現己在免疫化學和組織化學研究中得到了廣泛應用，膠體金顆粒之所以能成為電鏡下較為理想的免疫標記物，是因為它主要有如下優勢：①膠體金顆粒在電鏡下具有很高的電子密度，大小顆粒清晰可辨，且不影響對原有超微結構的觀察。②通過計量被檢部分的膠體金顆粒，可以對被檢抗原或抗體進行免疫定量研究。

有一些關于異源三聚體Ｇ蛋白十六酞化物位點和亞細胞定位之間相沖突的關系的報道，研究認為從堅持α亞基的膜定位到堅持從膜到細胞溶質的活化依賴移位是去十六酞化物的作用導致［６］。對無脊椎動物感光器中Ｇｑ蛋白的定位研究較少，用免疫組織化學的方法在鱟側眼的冰凍切片中觀察免疫反應發現，ＦＩＴＣ熒光集中在小眼的視桿部位，在小眼的視網膜細胞或其他細胞的胞質中幾乎沒有免疫反應［７］。在超微結構定位上，用免疫膠體金標記了感光器中的Ｇｑ蛋白α亞基，光敏感的微絨毛部位的金粒密度是胞質部位的３倍以上。在鰲蝦的感光器中，用同樣的方法觀察Ｇｑ蛋白α亞基，在光照條件下Ｇｑ蛋白α亞基從視桿微絨毛膜上移位至胞質中，在黑暗中又移回到視桿微絨毛膜上［７－１０］。Ｇｑ蛋白β亞基在光適應與暗適應時的定位模式與Ｇｑ蛋白α亞基非常相似，這表明它們定位的變化是同步的［４，５］。在多毛綱動物感光器中，免疫膠體金電鏡技術表明Ｇｑ蛋白α亞基主要分布在視桿微絨毛的膜上。

十六酞化和去十六酞化對Ｇｑ蛋白α亞基的脂類修飾很可能是造成其形式轉變的原因［４］。己發現烏賊的Ｇｑ蛋白α亞基的第３、４位點上的半胱氨酸殘基是潛在的十六酞化的位點。用β－巰基乙醇處理烏賊感光器時，Ｇｑ蛋白α亞基及β、γ亞基從膜上分離出來，這表明一種不穩定的脂類修飾對Ｇｑ蛋白錨定到膜上起重要作用［６］。巰基乙醇可以解離Ｇｑ蛋白α亞基，且偶氮胂Ⅲ也可以解離鰲蝦中Ｇｑ蛋白α亞基，已知高濃度的偶氮胂Ⅲ可以裂解硫脂或酯型脂肪酸鍵，用偶氮胂Ⅲ處理烏賊的感光器膜，發現膜結合的Ｇｑ蛋白α亞基從膜上解離出來［６］，表明硫脂的裂解產生了溶解性的Ｇｑ蛋白α亞基。因此推測可溶性的Ｇｑ蛋白α亞基的增加是由于脂肪酸從膜結合的Ｇｑ蛋白α亞基上移走，使得膜結合的Ｇｑ蛋白α亞基轉變為無活性的可溶性的Ｇｑ蛋白α亞基。羅氏沼蝦感光細胞中Ｇｑ蛋白α亞基的形式轉變機制還有待進一步的研究。

參考文獻：

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收稿日期：２０１２－０３－０１

基金項目：信陽師范學院青年骨干教師項目；河南省青年骨干教師項目

作者簡介：馮志國（１９７９－），男，河南安陽人，副教授，博士，主要從事動物生物技術的研究工作，（電話）０３７６－６３９１３８０，１３６３６３９２８７０（電子信箱）

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