對二氯苯對濕地土壤細菌群落多樣性的影響

徐文品 丁成 楊春生 朱光燦 楊唐儀

摘要：利用聚合酶鏈式反應－變性梯度凝膠電泳（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ）考查了對二氯苯脅迫對濕地土壤細菌群落多樣性的影響。通過不同培養時間（４、１８和４５ ｄ）和不同培養濃度（１２０、２４０、３６０和６００ ｍｇ／ｋｇ）對二氯苯污染下濕地土壤細菌群落基因組的變性梯度凝膠電泳（ＤＧＧＥ）多樣性分析。結果表明，各處理下的土壤細菌群落多樣性在不同處理時間有明顯差異。培養初期對二氯苯對土壤細菌群落抑制作用非常顯著，土壤細菌中某些群落的生長受到抑制；不同處理在處理后期差異很小。在土壤培養初期，含對二氯苯２４０ ｍｇ／ｋｇ的培養基上出現一條新增條帶，為對照和低濃度對二氯苯土壤所沒有，說明土壤中存在對二氯苯生長優勢菌。

關鍵詞：變性梯度凝膠電泳（ＤＧＧＥ）；對二氯苯；濕地土壤細菌菌群；多樣性

中圖分類號：Ｑ９３５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）18－4134-04

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ １，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｏｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｗｅｔｌａｎｄ Ｓｏｉｌ

ＸＵ Ｗｅｎ－ｐｉｎ１，２，ＤＩＮＧ Ｃｈｅｎｇ1，２，ＹＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｓｈｅｎｇ１，２，ＺＨＵ Ｇｕａｎｇ－ｃａｎ３，ＹＡＮＧ Ｔａｎｇ－ｙｉ１，２

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ ２１２０１３，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｙａｎｃｈｅｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｃｈｅｎｇ ２２４０５１，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；

３．Ｙａｎｃｈｅｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｔｅｓｔ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｙａｎｃｈｅｎｇ ２２４０５１， Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（１２０，２４０，３６０ ａｎｄ ６００ ｍｇ／ｋｇ） ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ （４， １８ ａｎｄ ４５ ｄ） ｏｎ ｗｅｔｌａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅａｃｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ on ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ differed ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｔｉｍｅ． Ｉｎ ｅａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｅｒｉｏｄ， ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ． Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎ ｌａｔｅｒ ｐｅｒｉｏｄ ｗａｓ ｌｉｔｔｌｅ． Ｉｎ ｅａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｅｒｉｏｄ， ａ ｎｅｗ ｍｅｄｉｕｍ ｂａｎｄ ｅｍｅｒｇｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ２４０ ｍｇ／ｋｇ ｏｆ 1，4－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， indicating ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ resistant to 1，4－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｉｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＤＧＧＥ； １，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ； ｗｅｔｌａｎｄ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ

土壤微生物在土壤生態中扮演了重要角色［１］，并且參與地球生物生態系統的化學循環，進行污染物質的降解［２，３］。但是由于土壤微生物個體微小、數量眾多、土壤環境條件復雜等原因，用常規的分離培養法很難全面有效地評估土壤中微生物群體多樣性及環境污染對土壤微生物的影響，極大地限制了人們對土壤微生物的認識［４］。伴隨分子生物學技術在環境科學領域的不斷應用，不經傳統培養，直接從土壤中抽取出土壤微生物總ＤＮＡ，利用微生物遺傳多樣性及區系基因變化來進行污染物環境效應的評價，正在被廣泛采用［５－７］。

研究排除其他因素，通過提取濕地土壤細菌群落總ＤＮＡ，經ＰＣＲ擴增、變性梯度凝膠電泳（ＤＧＧＥ），獲得土壤細菌群落１６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ３序列分布，以此研究對二氯苯對土壤細菌群落多樣性的影響。旨在為更直接更可靠地反映對二氯苯脅迫下濕地土壤細菌群落的組成情況，評估污染條件下土壤微生物的多樣性。

１材料與方法

１．１供試土壤

供試土壤取自鹽城海濱濕地土壤，無人為污染。收集１０～２０ ｃｍ處新鮮土壤，室內陰干，研磨，充分混勻，過４０目篩。

１．２試驗設計

試驗選擇２０ ｃｍ × ４０ ｃｍ的塑料桶，桶內加入２ ｋｇ土壤，加入適量去離子水，使水面浸過土壤１～２ ｃｍ。桶內加入配制好的對二氯苯母液，使桶內對二氯苯濃度分別為０、１２０、２４０、３６０和６００ ｍｇ／ｋｇ，每組３次重復，室溫２０ ℃培養。培養過程中不斷補水，保證水位高于土壤１～２ ｃｍ。分別在第四天、第１８天和第４５天時，從桶內０～１０ ｃｍ深度處取土樣１０ ｇ，采集后的土壤樣品－２０ ℃保存。

１．３土壤中細菌群落ＤＮＡ的提取

２ ｇ土壤樣品加０．２５ ｇ直徑０．１ ｍｍ 玻璃珠，再加２ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ８．０磷酸緩沖液，混勻５ ｍｉｎ，室溫３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２ ｍｉｎ；提上清液，室溫１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，棄上清液，加入３７０ μＬ消化液（１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣl， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸鈉，１．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１％ ＣＴＡＢ，ｐＨ ８．０），３０ μＬ １０％ ＳＤＳ，１０ μＬ溶菌酶 ，４６ ℃水?。?ｈ，加１０ μＬ蛋白酶Ｋ（２０ ｍｇ／ｍＬ）水浴４ ｈ；加５００ μＬ氯仿、苯酚混合物，混勻１０ ｍｉｎ，室溫１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心，留上清液，加等體積氯仿－異戊醇 （２４∶１，Ｖ／Ｖ） 混勻１０ ｍｉｎ；室溫８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心 ５ ｍｉｎ，留上清液，加醋酸鈉 ３０ μＬ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，加１ ｍＬ ７０％ 乙醇，室溫１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心 ５ ｍｉｎ；棄上清液，倒置風干，加５０ μＬ ｐＨ ８．０ ＴＥ緩沖液。取一定量樣品進行１％的瓊脂糖凝膠電泳，檢測土壤細菌群落總ＤＮＡ 的提取質量［８］。

１．４ＰＣＲ擴增

擴增反應體系：１０×ＰＣＲ緩沖液５ μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ） ４ μＬ，ｄＮＴＰ ２ μＬ，上下游引物各１．５ μＬ，模板ＤＮＡ １ μＬ，Ｔａｑ酶 （１０ ０００ Ｕ／ｍＬ） ０．５ μＬ，加去離子水至50 μＬ。反應條件為：９５ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，５４ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，共進行３０個循環；７２ ℃延伸１0 ｍｉｎ。ＰＣＲ反應在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ公司的２２３３１型ＰＣＲ儀上進行。反應結束后取５ μＬ反應液在１％的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。用于１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ擴增反應的引物序列為：３３８Ｆ（ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ）和５１８Ｒ（ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ）。

１．５變性梯度凝膠電泳和染色

ＰＣＲ產物加入到８％（ｍ／Ｖ）聚丙烯酰胺凝膠中，凝膠的變性范圍為４０％～６０％。利用ＤＧＧＥ－１Ｂ型電泳系統，在６０ ℃、１５０ Ｖ、１×ＴＡＥ Ｂｕｆｆｅｒ下電泳３３０ ｍｉｎ。電泳結束后，用固定液（１０％冰醋酸）固定凝膠２０ ｍｉｎ，用去離子洗滌凝膠3次，每次２ ｍｉｎ，取出凝膠板豎起控水１５ ｓ，將洗后的凝膠浸泡在染色液（含０．１５％硝酸銀和１５０ μＬ甲醛的混合液）中２０ ｍｉｎ，然后取出凝膠，在去離子水中浸洗１０ ｓ，立即浸泡在顯影液（含２．５％無水碳酸鈉和２５ μＬ甲醛的混合液）中，緩慢地搖晃至條帶完全顯現。將凝膠置于中止液（０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ－Ｎａ２）中浸泡１０ ｍｉｎ，再用去離子水浸洗凝膠３次，取出凝膠豎起控水［９］。

１．６指紋圖譜生物信息學分析

采用Ｗａｒｄ法計算各樣品間的相似指數，ＤＧＧＥ指紋圖譜分析借助于Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司的凝膠成像系統進行條帶判讀，以配套軟件Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ進行遷移率、強度、面積計算，并計算樣品間的相似指數、繪制泳道間遺傳圖。

２結果與分析

２．１對二氯苯處理４ ｄ后濕地土壤細菌群落總ＤＮＡ的ＤＧＧＥ分析

圖１為不同濃度對二氯苯處理土壤４ ｄ后土壤細菌群落ＤＧＧＥ分析結果。由圖1可知，試驗初期，不同濃度對二氯苯脅迫下濕地土壤細菌群落的基因條帶出現較明顯的差別。與對照相比，低濃度對二氯苯脅迫下條帶變化不大，但其中條帶ａ、ｂ亮度變暗消失，條帶ｃ、ｄ亮度增加。表明濕地土壤中大多數細菌群落對低濃度對二氯苯有一定的耐受性，基本不受影響，甚至對某類微生物具有一定的刺激作用，產生新條帶，如條帶ｅ。而３６０ ｍｇ／ｋｇ時，某些微生物對較高對二氯苯脅迫較為敏感，數量大大降低，達到ＤＧＧＥ分辨率下限。電泳圖譜泳道間的遺傳簇關系（圖２）同樣印證了上述結果，在圖２中，對二氯苯濃度為１２０ ｍｇ／ｋｇ時與對照最為接近，第３、第４和第５泳道則與對照的相似性為５７．８％～７５．０％，較處理初期時明顯降低。隨著土壤中對二氯苯濃度的增加，土壤中細菌群落基因多樣性受到的影響也逐漸增強，到土壤對二氯苯濃度為２４０ ｍｇ／ｋｇ時，整個泳道條帶出現明顯差別。值得注意的是，在土壤處理４ ｄ時，２４０ ｍｇ／ｋｇ對二氯苯濃度下，出現一條新增條帶，而對照及其他濃度下土壤都沒有，說明土壤中可能有在對二氯苯較高濃度下良好生長的微生物種。

２．２對二氯苯處理１８ ｄ土壤細菌群落總ＤＮＡ的ＤＧＧＥ分析

圖３為不同濃度對二氯苯處理１８ ｄ土壤中細菌群落ＤＧＧＥ分析結果。由圖3可知，在處理１８ ｄ時，與對照相比，１２０ ｍｇ／ｋｇ對二氯苯脅迫與對照土壤的細菌群落有７７．４％的相似性，再次說明濕地土壤中大多數細菌對對二氯苯有耐受性，另一些細菌則受到了抑制，表現出條帶亮度變暗，如圖３中的條帶ａ、ｂ。第３和第４泳道上出現的條帶ｃ則表明在２４０ ｍｇ／ｋｇ和３６０ ｍｇ／ｋｇ濃度下有適應該濃度的細菌，在２４０ ｍｇ／ｋｇ濃度處理４ ｄ時出現的新條帶反映的可能是此種細菌，隨著土壤中對二氯苯的揮發，原來３６０ ｍｇ／ｋｇ濃度降低至該種細菌能適應的濃度。由處理１８ ｄ時電泳圖譜泳道間的遺傳簇關系（圖４）可見，第２、第３和第４泳道與對照的相似性為７３．４％～７６．５％，較處理初期相比有所提升，而對二氯苯含量６００ ｍｇ／ｋｇ的相似性也從處理初期的６２．７％提高到了６９．４％。造成這種情況的原因可能是隨著對二氯苯的在土壤中的降解以及揮發，在土壤中的有效濃度降低，微生物的生長受到的抑制作用減小所引起的。值得注意的是，在土壤處理１８ ｄ時，原來在２４０ ｍｇ／ｋｇ濃度時出現的新條帶也在３６０ ｍｇ／ｋｇ時出現了，而對照及其他處理都沒有，更加肯定了此種微生物能適應土壤中適宜的對二氯苯濃度。

２．３對二氯苯處理４５ ｄ土壤細菌群落總ＤＮＡ的ＤＧＧＥ分析

對二氯苯處理４５ ｄ時土壤細菌群落ＤＧＧＥ電泳圖譜與處理４ ｄ時相比發生了較大的改變，各濃度對二氯苯處理下條帶數目有所增加（圖５），在土壤培養４５ ｄ時，不同處理土壤樣品之間差異開始變小，對二氯苯濃度為１２０ ｍｇ／ｋｇ時譜型與對照的相似性為８４．３％，但亮度稍變暗；對二氯苯濃度為３６０ ｍｇ／ｋｇ時譜型與對照的相似度達到７１．５％。圖６中不同處理譜型與對照的相似性都在７０．０％以上，其中１２０ ｍｇ／ｋｇ處理時更是達到８４．３％。表明在土壤培養４５ ｄ時，不同對二氯苯濃度的土壤樣品之間的差異開始變小。

３結論

通過對不同處理時間、不同濃度對二氯苯脅迫下濕地土壤的細菌群落總ＤＮＡ進行ＤＧＧＥ多樣性分析，結果表明，不同濃度對二氯苯對濕地土壤細菌組成產生了明顯影響。不同濃度對二氯苯不僅影響了組成細菌群落的細菌種群數目，還使細菌群落結構以及多樣性發生了改變。說明土壤細菌群落中各個種群是相互作用的，各土壤樣品細菌群落遺傳多樣性是對各種群的群體性反映。但是細菌群落遺傳多樣性并不是簡單地隨著對二氯苯濃度提高而減小。在較低濃度對二氯苯污染的樣點，ＤＧＧＥ圖譜條帶數目雖然變化不大，但組成圖譜的條帶亮度不同。說明不同種類的細菌不僅對對二氯苯的敏感性不同，而且對不同程度的對二氯苯污染敏感性也不同?？紤]到細菌種群之間諸如偏利、協同、共生、偏害、競爭等復雜的關系，可能是一定程度的對二氯苯污染改變了群落內部種群之間的關系，某些對對二氯苯敏感的細菌的消亡或者一些耐受對二氯苯的細菌產生的抗性保護了其他種群的細菌。細菌群落的耐受性可能是因為后天適應、基因突變或者通過群落結構中種群組成的改變而更具有耐受性。對二氯苯污染土壤微生態環境與細菌多樣性的內在關系主要表現在作用與反作用、抑制與適應、穩定與變異、誘導與重建的相互依存、相互影響、共同演化，其結果使得適應對二氯苯脅迫環境的優勢菌群得以保留，群落結構和多樣性發生變化，耐受性提高。

在研究中，在土壤處理初期含對二氯苯２４０ ｍｇ／ｋｇ的培養土中出現一條新增條帶，為對照及其他處理土壤所沒有，處理后期隨著對二氯苯濃度降低而消失，說明土壤中存在著適應對二氯苯適宜濃度而良好生長的細菌。

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（責任編輯鄭威）

收稿日期：２０１１－１０－２４

基金項目：江蘇省自然科學基金項目（ＢＫ２００９１７１）；江蘇省高校“青藍工程”基金項目

作者簡介：徐文品（1986-），男，甘肅蘭州人，在讀碩士研究生，研究方向為環境污染治理技術，（電話）１３０９２１７８０８９（電子信箱）ｘｘｘｘ１２１４４＠１２６．ｃｏｍ；

通訊作者，丁成，教授，博士，主要從事環境污染治理技術研究工作，（電話）１３８１５５８８０１１（電子信箱）１３８１５５８８０１１＠163．ｃom。