SSR法鑒定水稻兩系雜交種純度的運用與探討Ⅲ。兩個形態(tài)學(xué)差異較大的品種間摻雜回收試驗

廖芳麗 林梅 張宇飛 趙虹 熊先鋒 張凱 涂書新

摘要：在兩系雜交稻兩優(yōu)培九的大群體田間純度鑒定中，定向摻入形態(tài)學(xué)差異較大的兩系雜交稻新兩優(yōu)６３８０，逐株抽取田間植株葉片樣品，運用ＳＳＲ法進行鑒定。結(jié)果表明，運用ＳＳＲ法能夠準確地檢測出摻入的新兩優(yōu)６３８０。在室內(nèi)檢測的譜帶中發(fā)現(xiàn)，新兩優(yōu)６３８０的帶型與兩優(yōu)培九不育系帶型的位置相同。

關(guān)鍵詞：兩系雜交稻；大群體；摻雜回收；帶型比對

中圖分類號：Ｓ５１１；Ｑ７８９文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）18－3941-02

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｅｄ Ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｔｗｏ－Lｉｎｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｒｉｃｅ ｂｙ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ （ＳＳＲ） Ⅲ．Ａｄｕｌｔｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔｗｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ

ＬＩＡＯ Ｆａｎｇ－ｌｉ１，ＬＩＮ Ｍｅｉ１，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ－ｆｅｉ１，ＺＨＡＯ Ｈｏｎｇ１，ＸＩＯＮＧ Ｘｉａｎ－ｆｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ２，ＴＵ Ｓｈｕ－ｘｉｎ３

（１． Ｓｅｅｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｊｉｎgｚｈｏｕ Ｃｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｊｉｎgｚｈｏｕ ４３４０２０， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ２．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎgｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｒｏｕｐｓ ｓｅｅｄｓ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ－ｌｉｎｅ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ ｖａｒｉｅｔｙ Ｌｉａｎｇｙｏｕｐｅｉ ９ ａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ ａｎｏｔｈｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｒｉｅｔｙ Ｘｉｎｌｉａｎｇｙｏｕ ６３８０ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｘｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＳＳＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｘｉｎｌｉａｎｇｙｏｕ ６３８０ ａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘａｃｔｌｙ． Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌａｎｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｘｉｎｌｉａｎｇｙｏｕ ６３８０ ａｎｄ Ｌｉａｎｇｙｏｕｐｅｉ ９ ｓｔｅｒｉｌｅ ｌｉｎｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｗｏ－ｌｉｎｅ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ； ａ ｌａｒｇｅ ｇｒｏｕｐ； ａｄｕｌｔｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ； ｌａｎｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ

由于ＤＮＡ提取方法的簡化、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的運用，以及ＳＳＲ分子標記鑒定兩系雜交水稻種子純度具有快速、重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點，使得ＳＳＲ法成為目前室內(nèi)鑒定兩系雜交水稻種子純度時應(yīng)用最為廣泛的分子標記方法［１－６］。但是瓊脂糖凝膠電泳成像的譜帶分辨率低，信息量不充分，譜帶的主帶一般表現(xiàn)為不育系、恢復(fù)系和雜交種３種類型，不能區(qū)分不同的雜株類型。

為驗證該方法的可靠性和準確性，前人的研究一般是在鑒定時，采取人為在鑒定樣品中摻入該組合的恢復(fù)系、保持系、不育系的方法來檢驗［７－９］。但在田間正季種植鑒定條件下，用兩系雜交水稻種子大群體定位摻雜回收，且對摻入的雜交種子雜株譜帶特征的研究目前鮮有報道［１０－１３］。

此次研究的目的在于了解單對引物對親緣關(guān)系較遠的品種的識別率，驗證單對引物ＳＳＲ法測定親緣較遠的兩系雜交水稻種子純度的準確性和可靠性，同時探討樣品中混入其他雜交種的譜帶特征。

１材料與方法

１．１材料

試驗材料是在通過系譜比較后，選用遺傳背景不同、親緣關(guān)系較遠的兩優(yōu)培九（培矮６４Ｓ×９３１１）和新兩優(yōu)６３８０（０３Ｓ×Ｄ２０８）兩個品種。這兩個品種由荊州市種子管理局從市場上抽取商品種子，并經(jīng)生產(chǎn)企業(yè)確認。所用引物及試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。

１．２ＰＣＲ反應(yīng)體系

ＰＣＲ擴增反應(yīng)總體積１０μＬ：１０×ｂｕｆｆｅｒ １μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ０．２μＬ，５０ｎｇ／μＬ ｐｒｉｍｅｒ ０．２μＬ ＋０．２μＬ，２Ｕ／μＬ Ｔａｑ酶０．６μＬ，２５ｎｇ／μＬ ＤＮＡ １μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ６．８μＬ。ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９４℃預(yù)變性４ｍｉｎ；然后進行３５個循環(huán)的擴增，循環(huán)參數(shù)為９４℃、１５ｓ，５５℃、１５ｓ，７２℃、３０ｓ；最后在７２℃下延伸７ｍｉｎ。擴增產(chǎn)物在含ＥＢ的３％瓊脂糖凝膠中進行電泳后，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

１．３摻雜和抽樣方法

試驗于２０１１年４月１５日播種，５月１５日移栽。小區(qū)單本栽植５００株苗，５０行，每行１０株，行距２６．７ｃｍ，株距１６．７ｃｍ。每個植株用４位數(shù)編號，前兩位數(shù)表示所在的行數(shù)，后兩位數(shù)表示所在行的位置，例如０５０８表示第５行的第８株。在兩優(yōu)培九田間鑒定移栽時，每隔9株混栽１株新兩優(yōu)６３８０。兩個品種之間的植株特征特性差別較大，易于田間識別（表１）；同時兩個品種之間的遺傳背景差異較大，易于室內(nèi)檢出。

返青后按對應(yīng)編號采取田間各植株的倒二葉葉片，用ＲＭ１１對兩優(yōu)培九進行室內(nèi)分子檢測，為了防止人為因素干擾，試驗過程中將摻雜、田間鑒定和室內(nèi)ＳＳＲ檢測的操作分別由３批不同的專業(yè)人員獨立完成。

１．４結(jié)果比對

在抽穗前及齊穗后分兩次按ＧＢ／Ｔ ３５４３．５－１９９５進行田間純度鑒定，并將田間結(jié)果與室內(nèi)ＳＳＲ法的純度檢出結(jié)果進行比對，驗證室內(nèi)與田間結(jié)果的一致性。

２結(jié)果與分析

２．１混入的雜株田間和室內(nèi)鑒定結(jié)果

室內(nèi)ＳＳＲ法將小區(qū)的所有植株都抽樣檢測，共檢出雜株６８株，其中摻入的新兩優(yōu)６３８０共５０株，樣品自有雜株１８株，摻入株的檢出率為１００％。摻入的新兩優(yōu)６３８０譜帶特征如圖１所示。

從表２中可見，兩優(yōu)培九田間鑒定中，共發(fā)現(xiàn)雜株６２株，其中摻入的新兩優(yōu)６３８０共５０株，樣品自有雜株１２株，摻入株的檢出率為１００％。

２．２雜株譜帶與兩優(yōu)培九及其親本的譜帶比較

引物篩選時，兩優(yōu)培九的不育系帶型在雜交種互補帶型的下方，恢復(fù)系帶型在雜交種互補帶型的上方。摻入的新兩優(yōu)６３８０的帶型均在互補帶型的下方，與兩優(yōu)培九不育系的譜帶位置相同。

３小結(jié)與討論

研究表明，應(yīng)用ＳＳＲ法對兩系種子純度進行鑒定時，雖能準確地把摻入的親緣關(guān)系較遠的其他兩系雜交稻品種識別出來，但不能僅根據(jù)室內(nèi)ＳＳＲ法電泳得到的雜株譜帶類型簡單地推斷其田間形態(tài)為不育系或恢復(fù)系類型雜株，必須進行田間比對才能作出準確判斷。

結(jié)合文獻［１４］的結(jié)論可以看出，對特定品種及適宜的引物而言，如果田間雜株為真實的不育系或恢復(fù)系，ＳＳＲ法的譜帶一定為不育系或恢復(fù)系的特征譜帶，反之，如果譜帶表現(xiàn)為不育系或恢復(fù)系的特征譜帶，植株田間表現(xiàn)型并不一定是不育系或恢復(fù)系。

對與親緣關(guān)系較近的品種，因為親本間遺傳差異較小，而ＳＳＲ法標記的是一些無意義的ＤＮＡ重復(fù)序列，這些ＤＮＡ片段很可能都會在親緣關(guān)系較近的品種中普遍存在，從而使親緣關(guān)系較近但田間表現(xiàn)型差異明顯的品種顯示出相同的帶譜，從而產(chǎn)生種子純度誤判風(fēng)險，這方面還需進一步研究。

參考文獻：

［１］辛業(yè)蕓，張展，熊易平，等．應(yīng)用ＳＳＲ分子標記鑒定超級雜交水稻組合及其純度［Ｊ］．中國水稻科學(xué)，２００５，１９（２）：９５－１００．

［２］馬秀芳，華澤田，隋國民，等．利用微衛(wèi)星標記鑒定北方雜交粳稻種子純度的研究［Ｊ］．雜交水稻，２００６，２１（５）：５６－５８．

［３］黃成志，黃文章，嚴明建，等．利用ＳＳＲ分子標記鑒定雜交水稻真?zhèn)闻c純度［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，３７（８）：３４３７－３４３８．

［４］ 譚智丹，余顯權(quán)，高健強，等．利用ＳＳＲ鑒定雜交水稻種子純度的研究［Ｊ］．種子，２００６，２５（４）：２７－３３

［５］ 劉之熙，陳祖武，朱克永，等．利用ＳＳＲ分子標記快速鑒定雜交水稻種子純度技術(shù)體系的優(yōu)化［Ｊ］．雜交水稻，２００８，２３（１）：６０－６３．

［６］ 樊葉楊，莊杰云．應(yīng)用微衛(wèi)星標記鑒別水稻秈粳亞種［Ｊ］．遺傳，２０００，２２（６）：３９２－３９４．

［７］ 李穩(wěn)香，詹慶才．雜交水稻種子純度ＳＳＲ指紋圖譜標記鑒定技術(shù)研究［Ｊ］．中國種業(yè)，２００６（３）：２１－２２．

［８］ 詹慶才．利用微衛(wèi)星ＤＮＡ標記進行雜交水稻種子純度鑒定的研究［Ｊ］．雜交水稻，２００２，１７（５）：４６－５０．

［９］ 薛燦輝，朱克永，陳祖武，等．利用微衛(wèi)星標記鑒定金優(yōu)２０７雜種純度技術(shù)研究〔Ｊ〕．湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００５（５）：６－８．

［１０］ 金偉棟，洪德林．雜交水稻品種純度鑒定研究進展［Ｊ］．種子，２００５，２４（８）：４９－５４．

［１１］ 陳兆貴，梁展鵬．雜交水稻種子純度分子鑒定技術(shù)研究［Ｊ］．中國種業(yè)，２００９（１）：５０－５２．

［１２］ 張輝，姜勇．雜交水稻品種鑒定和純度分析技術(shù)研究進展［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，３７（２０）：９４１６－９４１９．

［１３］ 殷兆晴，王玉平，周黎軍，等．雜交稻種子純度的ＳＳＲ分子檢測及應(yīng)用研究［Ｊ］．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，２００６，１９（６）：１０００－１００４．

［１４］ 張凱，趙虹，張宇飛，等． ＳＳＲ法鑒定水稻兩系雜交種純度的運用與探討Ⅰ．親本和雜交種分別篩選引物的適應(yīng)性［Ｊ］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１２，５１（１０）：１９６５－１９６６，１９７０．

（責任編輯鄭威）

收稿日期：２０１２－０４－１１

基金項目：國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（２０１１０３００７）

作者簡介：廖芳麗（１９７８－），女，湖北天門人，助理農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗及管理工作，（電話）０７１６－８４４３２５２（電子信箱）

ｊｙｊｙｋ５０２＠１６３．ｃｏｍ；通訊作者，張凱（１９８３－），男，在讀碩士研究生，研究方向為農(nóng)作物育種，（電話）０７１６－８４００６４３（電子信箱）

ｆｏｎｇｙｕｎ００＠ｔｏｍ．ｃｏｍ。