玉米絲軸黑粉菌原生質體制備與再生條件的研究

寧平　梁萍　向妮　鄭用璉　肖炎農

摘要：以玉米絲軸黑粉菌（Sporisorium reilianum f.）為供試菌株，對其孢子原生質體的制備和再生條件進行研究。結果表明，交配型菌株SR1加入5 mg/mL溶壁酶（Lysing Enzymes）、50 mg/mL崩潰酶（Driselase）與50 mg/mL蝸牛酶（Snailase）混合酶液，置于28 ℃ 100 r/ min搖床上酶解10 min，原生質體得率為99.36%、產量1.35×108個/mL，以山梨醇為穩滲劑，原生質體涂布于含有1.0 mol/L山梨醇的CM再生培養基上，再生率可達35.63%。

關鍵詞：玉米絲軸黑粉菌；原生質體；制備；再生

中圖分類號：S435.131.42文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2012）20-4520-04

玉米絲黑穗病是由玉米絲軸黑粉菌（Sporisorium reilianum f. ）引起的嚴重威脅玉米產量的病害。20世紀90年代前在中國發生較重，以后由于抗病品種的推廣有所減輕。近年來，由于新品種的引進和抗性鑒定工作的滯后，玉米絲黑穗病又逐年加重，每年因玉米絲黑穗病危害減產達30萬t[1]。玉米絲軸黑粉菌在玉米發芽期侵染，花期觀察到明顯癥狀，雌雄穗產生充滿孢子堆的病癭，表現為典型的苗期侵染、花期發病特點。一旦發病，往往整株都沒有收成。雖然該病在苗期也有些癥狀，如植株矮小、莖基膨大如筍狀、葉片簇生等，但是癥狀不明顯，且不容易與其他病毒病、生理病害、根部蟲傷等所致癥狀相區分，因此難以在苗期發現病情，給該病的早期防治帶來一定難度。有學者研究苗期玉米絲黑穗病的檢測技術，進行了質壁分離法PCR檢測技術鑒定[2]以及利用苗期檢測可溶性糖含量鑒定[3]等，這些方法有一定的局限性，難以應用于實際生產。人們選育較好的抗性品種用于玉米絲黑穗病防治，研究者在玉米抗玉米絲黑穗病育種方面的研究較多，如抗性機理、抗性遺傳、抗病基因定位和抗病種質資源[4]等。從分子水平研究玉米絲軸黑粉菌的致病機制，有助于從根本上控制該病的危害。目前對玉米絲黑穗病菌的遺傳轉化國內外鮮有研究報道。試驗通過制備該菌的原生質體，發展出有效的遺傳轉化體系，為研究玉米絲黑穗病菌的致病機制提供基礎。

1.2試驗方法

1.2.1原生質體的制備和影響因素測定玉米絲軸黑粉菌菌種接入PDA培養基中培養3 d，取1/20接種量轉至新的PDA培養基繼續培養24 h，離心收集菌體，無菌水洗滌1次，加入酶液（表1）后，置搖床上28 ℃ 100 r/ min酶解。每隔 5 min取樣鏡檢觀察，待視野中絕大多數孢子釋放原生質體時停止酶解，2 000 r/ min離心 6 min后用STC緩沖液洗滌3次，離心收集原生質體。

1）不同酶及組合對原生質體制備的影響。以不同濃度的溶壁酶、崩潰酶、蝸牛酶單獨處理或者混合處理玉米絲軸黑粉菌的擔孢子，比較單一酶和混合酶對原生質體釋放的影響。

2）不同滲透壓穩定劑對原生質體制備的影響。用CPB配制不同濃度的NaCl、MgCl2、KCl、D-sorbitol、蔗糖5種滲透壓穩定劑，比較不同滲透壓穩定劑及不同濃度對原生質體制備的影響，確定最佳滲透壓穩定劑[6]。

3）菌齡對原生質體制備的影響。將活化3 d后的玉米絲軸黑粉菌菌液以1/20的接種量擴大培養，收集不同時間段的擔孢子以5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶和50 mg/mL蝸牛酶3種酶混合酶解，比較菌齡對原生質體制備的影響。

4）酶解時間對原生質體制備的影響。在酶解5、10、15、20、25 min時觀察原生質體的形成及數量。

5）酶解溫度對原生質體制備的影響。比較25、28、30、35、37 ℃ 5個酶解溫度對原生質體制備的影響。

1.2.2不同酶組合及酶解時間對原生質體再生的影響將不同酶濃度組合及不同酶解時間制備的原生質體用平板稀釋法涂布于含有1.0 mol/L山梨醇的CM再生培養基上，5～7 d后觀察菌落數量并計算再生率。

2.1影響原生質體制備的因素

2.1.1不同酶及其組合對原生質體制備的影響試驗結果見表2。酶的種類對原生質體釋放影響很大，當用溶壁酶單獨處理玉米絲軸黑粉菌擔孢子時，原生質體得率很低。即使延長酶解時間至180 min，原生質體得率也僅為5.33%。

兩種酶液混合處理的原生質體得率雖然有所提高，但是提高不多，原生質體得率為10%左右。用5 mg/mL溶壁酶、20 mg/mL崩潰酶和20 mg/mL蝸牛酶3種酶混合處理絲軸黑粉菌60 min時，原生質體得率為57.06%，與單一酶和兩種酶處理相比顯著提高。5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶、50 mg/mL蝸牛酶3種酶的混合液為制備玉米絲軸黑粉菌原生質體的最佳酶組合，酶解10 min原生質體得率為99.36%。制備得到的原生質體外觀見圖1。

2.1.2不同滲透壓穩定劑對原生質體制備的影響由于原生質體對滲透壓敏感，合適濃度的穩滲劑可以維持原生質體的內外滲透壓平衡。因此，穩滲劑的種類和濃度也非常關鍵。分別選用3種不同含量NaCl、MgCl2、KCl、山梨醇、蔗糖配制5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶、50 mg/mL蝸牛酶3種酶的混合液，觀察滲透壓穩定劑對原生質體產量的影響。結果見表3。

結果表明，1.0 mol/L蔗糖作為穩滲劑原生質體產量最高，1.0 mol/L山梨醇次之，為1.35×108個/mL。無機穩滲劑效果較差，原生質體之間容易融合成堆，說明無機物不適合用作玉米絲軸黑粉菌原生質體制備的穩滲劑。從原生質體產量和聚集情況綜合考慮，確定以1.0 mol/L山梨醇作為穩滲劑制備玉米絲軸黑粉菌原生質體。

2.1.3菌齡對原生質體制備的影響細胞壁的成分和結構在細胞的不同生長時期有所不同，導致細胞壁對溶壁物質敏感性的差異。將活化培養3 d后的菌液以1/20的接種量擴大培養，收集不同時間段的擔孢子，以5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶、50 mg/mL蝸牛酶3種酶混合液酶解，結果見圖2。從圖2可見，24 h為玉米絲軸黑粉菌擴大培養最佳菌齡時間，此時細胞壁最敏感，制備原生質體得率最高。此后隨培養時間延長原生質體得率降低。

2.1.4酶解時間對原生質體制備的影響酶解時間也是影響原生質體得率的重要因素之一，在酶解5、10、15、20、25 min時測定原生質體的得率，結果見圖3。由圖3可知，酶解10 min時，原生質體的得率最高，達99.36%。此前隨著酶解時間的延長，原生質體的得率增加；此后隨著酶解時間的延長，原生質體的得率有所下降。

2.1.5酶解溫度對原生質體制備的影響酶解溫度對原生質體得率的影響試驗結果見圖4。由圖4可見，28 ℃為酶解的最適溫度，超過或低于28 ℃原生質體得率明顯下降。

2.2原生質體的再生情況

酶的組合和酶解時間對原生質體再生有一定的影響（表5）。酶濃度低，需要的處理時間長，會使先形成的原生質體破裂，造成再生率低。

3小結與討論

試驗研究了玉米絲軸黑粉菌孢子原生質體的制備和再生條件，結果表明，菌株SR1活化3 d后以1/20的接種量繼續培養24 h，離心收集的菌體加入5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶、50 mg/mL蝸牛酶混合酶液，置于28 ℃ 100 r/ min搖床上酶解10 min，原生質體得率為99.36%，以山梨醇為穩滲劑產量可達1.35×108個/mL，再生率為35.63%。

玉米絲軸黑粉菌為擔子菌亞門病原真菌，其擔孢子細胞壁主要成分是幾丁質（幾丁聚糖）和葡聚糖，用單一酶如蝸牛酶、溶壁酶、崩潰酶，都不能完全降解細胞壁以產生足夠的原生質體[5-8]。蝸牛酶雖然是復合酶，可能是由于所含酶的種類關系，更適合于降解含有較多葡聚糖的真菌。崩潰酶作為另外一類復合酶，在多種植物病原真菌的原生質體制備中得到應用[9]，但單獨使用對玉米絲軸黑粉菌孢子酶解作用也較差，溶壁酶單獨使用效果也不理想。這說明玉米絲軸黑粉菌孢子的細胞壁成分比較特殊，很難用一種通用酶去除。試驗中，2種以上酶混合作用于玉米絲軸黑粉菌孢子可獲得較高的原生質體得率，用5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶和50 mg/mL蝸牛酶混合作用可使孢子在短時間內完全溶壁。制備真菌的原生質體時濃度適宜的混合酶較單一酶更好，這個結論與前人的研究結果一致[10，11]。在酶解時間對原生質體的影響試驗中，鏡檢可觀察到原生質體在酶液中隨時間延長逐漸減少，后續試驗中再生率也有所降低，可見酶對原生質膜有一定破壞作用。酶濃度提高時，所含其他雜酶也相應提高，更容易破壞原生質體并影響其活性。

試驗中有機化合物作為穩滲劑效果要比無機化合物好，這與前人報道一致[8]。無機化合物作為穩滲劑容易使原生質體發生聚集，這種情況可能會影響到后續的再生和轉化。

菌體能否產生大量活性高的原生質體與菌體本身的生理狀態有一定的關系。酶的作用受菌齡的影響，菌齡過大菌體的細胞壁老化增厚，酶解難度增加，原生質體釋放難度較大；通過大幅增加酶解時間菌體更容易釋放原生質體，但是原生質體容易破裂且不容易再生，所以掌握菌齡對于制備原生質體非常重要。在酶濃度與酶解時間這兩個因素當中，酶解時間對再生的影響較大。隨著酶解時間延長，原生質體再生能力下降。

參考文獻：

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