水稻TWH基因RNAi載體的構建及遺傳轉化

李進波　查中萍　萬丙良　戚華雄

摘要：根據ＲＮＡｉ表達載體的設計原則，以ＴＷＨ基因為靶基因，將長度２５３ｂｐ目的片段通過正反兩個方向插入表達載體ｐＲ１３０１中，構建ＲＮＡｉ表達載體ｐＲ１３０１－ＴＷＨ。通過根癌農桿菌ＥＨＡ１０５介導法將其導入水稻品種武育粳３號，獲得３４株陽性轉基因植株，為進一步深入研究ＴＷＨ基因功能奠定了基礎。

關鍵詞：水稻（OryzasativaL.）；ＴＷＨ基因；ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）；載體構建；遺傳轉化

中圖分類號：Ｓ５１１；Ｑ７８１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5791-03

ＲＮＡ干涉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是指內源性或外源性雙鏈ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）介導的同源ｍＲＮＡ發生特異性降解，導致靶基因的表達沉默從而產生相應的功能表型的缺失現象，屬于轉錄后的基因沉默現象。ＲＮＡｉ是在研究秀麗新小桿線蟲中被首次發現［１］，利用這一技術可以有效、特異性降解靶標基因ｍＲＮＡ，阻止靶標基因的表達，從而研究目標基因的功能。

目前，水稻中已有許多利用ＲＮＡｉ技術進行基因功能分析或驗證的報道［２－４］。從水稻育種后代材料中發現一個水稻穎殼扭曲突變體，該突變體主要表現為穎殼扭曲變形，子粒充實不飽滿［５］。進一步的研究結果表明，該突變體穎殼扭曲性狀受一對隱性基因控制，其對應的ＴＷＨ基因被精細定位在第二染色體的ＳＳＲ標記ＲＭＬ２５和ＲＭＬ３５之間，兩個ＳＳＲ標記間的物理距離為１１．９ｋｂ，并確定了其候選基因。該研究通過構建水稻ＴＷＨ基因的ＲＮＡｉ表達載體，利用根癌農桿菌ＥＨＡ１０５介導法將其導入水稻品種武育粳３號中，獲得了轉基因水稻植株，為ＴＷＨ基因的功能研究奠定了基礎。

１ 材料與方法

１．１ 試劑

１．２ 載體及菌株

１．３ 植物材料和遺傳轉化方法

供試水稻材料為武育粳３號成熟種子誘導初生愈傷組織，作為與農桿菌共培養轉化的受體材料。水稻的組織培養、農桿菌介導轉化水稻以及抗性愈傷組織的篩選與植株再生等參照劉巧泉等［６］建立的高效轉化方法進行。

１．４ ＰＣＲ引物設計及目的片段擴增

１．５ 目的片段的克隆

將目的片段切下，通過膠回收試劑盒回收ＰＣＲ產物并純化后連接到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上，轉化大腸桿菌ＤＨ５α感受態細胞，涂布在含１００ｍｇ／Ｌ氨芐青霉素的Ｘ－Ｇａｌ／ＩＰＴＧ的ＬＢ固體培養基上，３７℃培養過夜，挑取白色單菌落于含１００ｍｇ／Ｌ氨芐青霉素的ＬＢ液體培養基中培養過夜，通過菌落ＰＣＲ篩選陽性克隆，獲得重組載體ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＷＨ，將陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

１．６ ＲＮＡｉ表達載體的構建

１．７ 轉基因植株的ＰＣＲ檢測

２ 結果與分析

２．１ ＲＮＡｉ表達載體構建

２．２ 水稻遺傳轉化及轉基因植株的獲得

以武育粳３號成熟胚誘導的愈傷組織作為轉化受體，經根癌農桿菌ＥＨＡ１０５介導的遺傳轉化方法將表達載體ｐＲ１３０１－ＴＷＨ導入水稻中。經潮霉素抗性篩選，選擇生長旺盛的抗性愈傷組織進行分化再生培養，最終獲得４０株T0代轉基因植株。以轉基因植株葉片總ＤＮＡ為模板，用潮霉素基因特異引物Ｐ７與Ｐ８進行ＰＣＲ檢測（圖５），共有３４株檢測到５１７ｂｐ左右的目標片段，ＰＣＲ陽性率為８５％。

３ 小結與討論

１）雖然ＲＮＡ干涉在作用機制等方面還不十分清楚，但作為一種新的技術方法，已經在各個不同的生物研究中被廣泛應用。應用ＲＮＡ干涉技術迅速地抑制目的基因的表達，能盡快了解到目的基因的功能。該研究將構建的表達載體ｐＲ１３０１－ＴＷＨ導入水稻愈傷組織中，獲得了陽性轉基因植株，下一步計劃將轉基因苗移栽到海南試驗基地，抽穗后進行表型鑒定和表達分析，研究ＴＷＨ基因的功能。

２）載體設計是載體構建的關鍵。由于ＲＮＡｉ機制只對成熟的ｍＲＮＡ產生作用，因此用于設計ＲＮＡ干涉載體的靶序列應處于基因的一個外顯子內。Ｗｅｓｌｅｙ等［７］的研究表明ＲＮＡｉ片段的長度在９８～８５３ｎｔ之間都是可行的，不會對沉默效率產生明顯影響；同時將間隔區內含子插入反向互補重復區可以增強其穩定性。因此，在本研究中我們選擇ＴＷＨ基因一個外顯子部分的２５３ｂｐ為靶序列構建ＲＮＡｉ載體，并在兩個反向重復序列間加入一個Ｗａｘｙ基因的內含子作為間隔區，目的是為了提高轉基因后代的沉默效率，有效抑制目的基因的表達。

參考文獻：

［１］ＦＩＲＥＡ，ＸＵＳＱ，ＭＯＮＴＧＯＭＥＲＹＭＫ，ｅｔａｌ．Ｐｏｔｅｎｔａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１（６６６９）：８０６－８１１．

［２］ＣＨＥＮＪ，ＴＡＮＧＷＨ，ＨＯＮＧＭＭ，ｅｔａｌ．ＯｓＢＰ－７３，ａｒｉｃｅｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｅｓａｎｏｖｅｌＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａＳＡＰ－ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎａｎｄｉｔｓｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎｈｉｂｉｔｓｒｉｃｅｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，５２（３）：５７９－５９０．

［３］ＰＲＡＳＡＤＫ，ＶＩＪＡＹＲＡＧＨＡＶＡＮＵ．Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｆａｒｉｃｅＰＩ／ＧＬＯｐａｒａｌｏｇ，ＯｓＭＡＤＳ２，ｕｎｃｏｖｅｒｓｉｔｓｓｅｃｏｎｄ－ｗｈｏｒｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，１６５（４）：２３０１－２３０５．

［４］ＸＩＡＯＨ，ＷＡＮＧＹ，ＬＩＵＤ，ｅｔａｌ．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｉｃｅＡＰ３ｈｏｍｏｌｏｇｕｅＯｓＭＡＤＳ１６ｂｙＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，５２（５）：９５７－９６６．

［５］ＬＩＪＢ，ＸＩＡＭＹ，ＷＡＮＢＬ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｍａｐｐｉｎｇｏｆＴＷＨｇｅｎｅｉｎｒｉｃｅｔｗｉｓｔｅｄｈｕｌｌｍｕｔａｎｔ［Ｊ］．ＲｉｃｅＳｃｉｅｎｃｅ，２００９，１６（１）：７９－８２．

［６］劉巧泉，張景六．根癌農桿菌介導的水稻高效轉化系統的建立［Ｊ］．植物生理學報，１９９８，２４（３）：２５９－２７１．

［７］ＷＥＳＬＥＹＳＶ，ＨＥＬＬＩＷＥＬＬＣＡ，ＳＭＩＴＨＮＡ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｄｅｓｉｇｎｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎｄｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００１，２７（６）：５８１－５９０．