綠色熒光蛋白在貴陽腐霉的組成性表達

劉萍　鄭慧玲　吳建偉　蘇曉慶

摘要：以潮霉素抗性基因ｈｐｈ為篩選標記，以雙元載體ｐＰＫ２為基本骨架，將增強型綠色熒光蛋白基因ｅｇｆｐ置于組成型啟動子ＰｇｐｄＡ和色氨酸Ｃ終止子ＴｔｒｐＣ之間，構建了組成性表達ｅｇｆｐ的載體ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ，利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化法，轉入貴陽腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）表達。對轉化子進行ＲＴ－ＰＣＲ和熒光顯微鏡檢測，結果表明，ｅｇｆｐ基因在貴陽腐霉轉化子中能穩定表達。

關鍵詞：貴陽腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）；基因轉化；綠色熒光蛋白；根癌農桿菌

中圖分類號：Ｑ７８６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5801-03

貴陽腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）是貴陽醫學院蘇曉慶教授于１９９４年分離得到的一株滅蚊真菌［１］。經研究證實它具有滅蚊能力較強、繁殖速度快、易于人工培養［２］和可移植性強以及對非靶生物相對安全等諸多優點［３，４］。由于昆蟲病原真菌廣泛存在于自然界，真菌制劑一旦釋放到自然環境中，需要準確鑒別染病昆蟲是否為人工釋放的菌株制劑所致，而在真菌制劑中引入安全、可靠的遺傳標記則為其提供了可能。增強型綠色熒光蛋白（Ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）是一種優化的突變型綠色熒光蛋白，其熒光比野生型強３５倍，具有結構穩定、高效表達、無種系依賴性等特點，通過與目標基因融合，可進行真菌的細胞基因表達和蛋白定位檢測及細胞示蹤標記、突變體致病力檢測、生態學行為以及與其他生物互作等研究，因此是目前標記研究真菌的重要手段之一。此次研究以貴陽腐霉菌絲體為受體材料，利用根癌農桿菌介導的遺傳轉化技術將含ｅｇｆｐ的表達載體轉入貴陽腐霉，以獲得帶有ＥＧＦＰ標記的貴陽腐霉菌株，為研究其對蚊幼蟲的入侵過程以及兩者之間的互作模式打下基礎。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．３ 引物 試驗所用引物序列見表１。

１．２ 方法

１．２．１ ｅｇｆｐ組成性表達載體ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的構建 用限制性內切酶ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ酶切質粒ｐＳＫ－ｈｐｈ，回收ＴｔｒｐＣ片段（７７０ｂｐ），與用相同酶切的質粒ｐＵＣ１８連接轉化，重組載體命名為ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ。以質粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１為模板，pＥＧＦＰ１和pＥＧＦＰ２為引物，ＰＣＲ擴增ｅｇｆｐ基因片段，用ＢａｍＨⅠ和 ＢｇｌⅡ雙酶切后純化回收，與同樣雙酶切的ｐＵＣ1８－ＴｔｒｐＣ連接，轉化驗證，命名為ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ。以質粒ｐＡＮ７－１為模板，用引物ＰｇｐｄＡ１和ＰｇｐｄＡ２ＰＣＲ擴增ＰｇｐｄＡ基因片段，用ＫｐｎⅠ和ＢａｍＨⅠ雙酶切后純化，回收該目的片段，與經過相同雙酶切的載體ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ連接，命名為ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ－ＰｇｐｄＡ，提取其質粒，用ＨｉｎｄⅢ酶切后電泳，凝膠回收３．６ｋｂ的大片段ＰｇｐｄＡ－ＥＧＦＰ－ＴｔｒｐＣ，與相同酶切的質粒ｐＰＫ２連接，篩選陽性轉化子，用ＢａｍＨⅠ單酶切驗證，得到正向連接的轉化子為質粒ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ。

１．２．２ ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的根癌農桿菌ＬＢＡ４４０４轉化 采用凍融法［５］。

１．２．３ 根癌農桿菌介導的ｅｇｆｐ基因在貴陽腐霉的遺傳轉化 按龍朝欽等［６］的方法稍改動。取含質粒ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的ＬＢＡ４４０４過夜培養物，用含２００μｍｏl／ＬＡＳ的ＹＥＰ液體培養基于２８℃振蕩培養６ｈ后，與貴陽腐霉菌絲混合，于２６℃培養１ｄ。棄上清，加入５００μＬＩＭ液體培養基（含２００μｍｏl／ＬＡＳ），于２６℃培養２ｄ。懸浮沉淀，將該混合物涂布到ＫＰＹＧ２平板上（含２００ｍｇ／Ｌ潮霉素Ｂ和２００ｍｇ／Ｌ頭孢霉素），于２６℃培養直至抗性菌絲長出。

１．２．４ 轉化子的ＲＴ－ＰＣＲ檢測 貴陽腐霉及轉化子總ＲＮＡ的提取采用ＴＲＩＺＯＬＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）提取。用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）逆轉錄并去除基因組ＤＮＡ。以pＥＧＦＰ１和pＥＧＦＰ２為引物，利用ＰＣＲ對得到的抗性菌落進行分子驗證，擴增ｅｇｆｐ基因片段。

１．２．６ 熒光的觀察 臨時制片，利用Ｏｌｙｍｐｕｓ熒光顯微鏡在波長４８０ｎｍ下進行熒光觀察、照相。

２ 結果與分析

２．１ ｅｇｆｐ組成性表達載體ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的構建與酶切驗證結果

２．２ 組成性表達ｅｇｆｐ重組菌株的篩選與驗證

２．３ 貴陽腐霉轉化株ｅｇｆｐ的熒光檢測

３ 討論

綠色熒光蛋白（ＥＧＦＰ）來源于海洋生物水母Ａｅｑｕｏｒｅａvｉｃｔｏｒｉａ，其作為報告基因已被廣泛地應用于絲狀真菌生物學研究中。２００９年，ＤｅＳｉｌｖａ等［７］將帶ＥＧＦＰ標記的植物病原真菌Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ接種４種植物宿主，通過對熒光的直接定量研究它對不同植物的損害情況。２００８年，Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ等［８］將帶有ＥＧＦＰ標記的曲霉菌接種到棉花種子中，利用ＥＧＦＰ標記監測真菌的生長、侵染途徑、定殖以及黃曲霉毒素的產生。另外，Ｈｕ等［９］利用含有ＥＧＦＰ的金龜子綠僵菌（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）基因重組菌株，研究在植物根際不同深度土壤中，昆蟲、植物和真菌三者之間的相互作用。金凱等［１０］將組成性表達ｅｇｆｐ的球孢白僵菌轉化株接種菜青蟲，利用冰凍切片和熒光顯微觀察技術可清楚地檢測到病原菌在昆蟲體表附著、菌絲穿透體壁以及菌絲從寄主體內長出等侵染過程。牛秋紅等［１１］也構建了含ｅｇｆｐ的重組質粒，轉化粉紅粘帚霉，為研究真菌侵染機理的模型打下了試驗基礎。

貴陽腐霉是一種重要的昆蟲病原真菌，開發其真菌制劑用于蚊蟲的生物防治很有價值。ＲＴ－ＰＣＲ和熒光顯微檢測顯示，ｅｇｆｐ基因在貴陽腐霉中已穩定表達，生物測定試驗也表明，具有較強熒光的轉化子的毒力與野生菌株相比沒有明顯改變。這一新的活體報告基因將在貴陽腐霉的侵染過程研究、基因調控、信號轉導及發育生物學和細胞生物學等多個領域中有更廣泛的應用。

參考文獻：

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［２］ＨＵＡＮＧＳＷ，ＳＵＸＱ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｎＰｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ，ａｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｍｏｓｑｕｉｔｏｌａｒｖａｅ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｙｓｔｅｍａ，２００７，２６（３）：３８０－３８８．

［３］劉 萍，蘇曉慶．滅蚊真菌貴陽腐霉Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ對大鼠的長期安全性測試［Ｊ］．菌物學報，２００７，２６（３）：４４０－４４７．

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［５］張邊江，陳全戰．質粒導入不同種農桿菌凍融法的探討［Ｊ］．湖北農業科學，２００７，４６（３）：３２９-３３１．

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［９］ＨＵＧ，ＳＴＬＥＧＥＲＲＪ．Ｆｉｅｌｄｓｔｕｄｉｅｓｕｓｉｎｇａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｙｃｏｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）ｒｅｖｅａｌｔｈａｔｉｔｉｓｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｃｏｍｐｅｔｅｎｔ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，６８（１２）：６３８３-６３８７．

［１０］金 凱，張永軍，羅志兵，等．利用ＧＦＰ表達系統檢測球孢白僵菌侵染昆蟲過程［Ｊ］．菌物學報，２００８，２７（３）：３７７-３８４．

［１１］牛秋紅，柯 濤，張 林，等．適用于粉紅粘帚霉綠色熒光標記的重組質粒的構建及應用［Ｊ］．微生物學報，２０１１，５１（７）：９９１－９９７．