水稻OsDCL3b基因組織表達分析和沉默載體的構建

岳怡涵　張健　廖鵬飛　李紹波

摘要：采用熒光定量ＰＣＲ方法分析了秈稻９３－１１根、莖、葉和花藥中ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的表達，發現水稻不同組織ＯｓＤＣＬ３ｂ的表達量存在明顯差異，花藥中表達量最多，根中表達量最少。重點構建了水稻ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的沉默載體，通過農桿菌介導轉化粳稻中花１１，獲得了轉基因Ｔ０代陽性植株，為進一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的功能打下了基礎。

關鍵詞：ＯｓＤＣＬ３ｂ基因；組織表達；載體構建；基因沉默；水稻

中圖分類號：Ｑ９４３．２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5788-03

Ｄｉｃｅｒ或Ｄｉｃｅｒ－ｌｉｋｅ（ＤＣＬ）蛋白通過產生ｓｉＲＮＡ（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇＲＮＡ）和ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）等小分子非編碼ＲＮＡｓ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓ，ｎｃＲＮＡｓ）［１］來調控其他相關基因的表達，進而影響真核生物的生長發育、抗病抗蟲性和逆境適應性等［２－４］。

在水稻中，已報道至少存在８個可能的ＤＣＬ蛋白基因［５］。最初，Ｌｉｕ等［６，７］對ＯｓＤＣＬ１和ＯｓＤＣＬ４進行了功能分析，發現ＯｓＤＣＬ１與ｍｉＲＮＡ的生物形成密切相關，缺失ＯｓＤＣＬ１的生物個體在幼苗期出現發育停滯現象，如植株矮化、葉片卷曲、根扭曲等現象。ＯｓＤＣＬ４主要影響大小為２１ｎｔ的ｓｉＲＮＡ的生物形成，與擬南芥同源基因ＡｔＤＣＬ４不同的是，沉默或缺失ＯｓＤＣＬ４既影響生物個體的營養生長，又影響生物個體的生殖生長，而ＡｔＤＣＬ４僅影響生物個體的營養生長。隨后，Ｕｒａｙａｍａ等［８］的研究表明，敲除ＯｓＤＣＬ２的轉基因植株中內源性ｄｓＲＮＡ病毒的含量水平將明顯降低，植株表現為矮化和育性降低等。Ｗｕ等［９］證實，ＯｓＤＣＬ３ａ與ｌｍｉＲＮＡ（ｌｏｎｇｍｉｃｒｏＲＮＡ）的產生密切相關。最近，Ｓｏｎｇ等［１０］進一步報道了ＯｓＤＣＬ４、ＯｓＤＣＬ３ｂ和ＯｓＤＣＬ１的功能；其中ＯｓＤＣＬ３ｂ的功能為首次報道，報道中僅指出了ＯｓＤＣＬ３ｂ的直接生物學功能是加工產生大小為２４ｎｔ的小ＲＮＡ，但這些小ＲＮＡ究竟調控哪些相關功能基因的表達，以及相關功能基因的表達變化又如何影響轉基因植株的生長發育、抗病抗蟲性或逆境適應性等尚未見報道。基于在秈稻９３－１１花藥中獲得的ＯｓＤＣＬ３ｂ的全長ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號：ＤＱ２０８４０６），采用熒光定量ＰＣＲ方法研究了秈稻９３－１１不同組織部位ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的表達差異，并利用ＲＮＡ干擾技術構建了ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的沉默載體，采用農桿菌介導法轉化粳稻中花１１，獲得了轉基因Ｔ０代陽性植株，為進一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因加工產生的各種小分子ｎｃＲＮＡ究竟調控了哪些相關基因的表達、進而影響轉基因植株的生長發育、抗病抗蟲性或逆境適應性等打下了重要的基礎。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 植物材料、菌種與質粒 秈稻９３－１１和遺傳轉化所用材料粳稻中花１１種子均由南昌大學生命科學與食品工程學院植物遺傳研究室保存。用于基因沉默的質粒ｐＹＬ為改造的ＲＮＡｉ－Ｕｂｉ［１１］，由華南農業大學劉耀光教授惠贈。大腸桿菌Ｔop１０Ｆ′、農桿菌ＥＨＡ１０５由南昌大學生命科學與食品工程學院植物遺傳研究室保存。

１．１．２ 主要試劑 ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＰＣＲ反應所用ＤＮＡ聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公司，質粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠ＤＮＡ回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，植物ＲＮＡ提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｔ４ＤＮＡ連接酶、限制性內切酶ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＭｌｕⅠ和ＰｓｔⅠ購自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，ＰＣＲ引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

１．２ 方法

１．２．１ 總ＲＮＡ的提取和正向干涉片段的ＲＴ－ＰＣＲ擴增 按Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＴＲＩｚｏｌ試劑盒提取秈稻９３－１１花藥的總ＲＮＡ后，將其反轉錄成ｃＤＮＡ，再用引物ＯｓＤＣＬ３ｂ－Ｓｉ：５′－ＡＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧ－３′和ＯｓＤＣＬ３ｂ－Ｘｉ：５′－ＣＣＧＧＡＡＧ

２ 結果與分析

２．１ ＯｓＤＣＬ３ｂ在秈稻９３－１１根、莖、葉和花藥中的表達結果

２．２ 沉默載體的構建結果

２．３ 轉基因Ｔ０代陽性植株的鑒定結果

３ 討論

前人的研究結果表明，粳稻ＯｓＤＣＬ３ｂ在營養組織中往往低水平表達，在花器官和種子發育初期則高水平表達［５］。本研究結果進一步顯示，秈稻ＯｓＤＣＬ３ｂ基因在秈稻９３-１１的花藥中表達量最高，在其他組織中表達量均較低，尤其是在根中的表達量幾乎只有花藥中的５０％。由此推測，ＯｓＤＣＬ３ｂ基因在水稻花藥中高水平表達可能是水稻穗子的生長發育所必需的，但有待于進一步試驗證實。

最近，Ｓｏｎｇ等［１０］首次報道了ＯｓＤＣＬ３ｂ的直接生物學功能是加工產生２４ｎｔ的小ＲＮＡ，但是，這些小ＲＮＡ具體調控了哪些相關基因的表達，進而可能會導致轉基因植株出現哪些差異表型等尚未見報道。研究獲得的轉基因Ｔ０代陽性植株為進一步研究ＯｓＤＣＬ３ｂ基因的功能打下了重要基礎。

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