富甘氨酸果蠅抗菌肽SK66的抗菌機制研究

馮志國　劉慧娟　李濤　陳正望

摘要：為了研究ＳＫ６６的抗菌機制，對Ｋ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６、Ｔｒｘ－ＳＫ６６進行序列比對和分析，結果發現Ｔｒｘ－ＳＫ６６是ＳＫ６６的氮端加了１個Ｔｒｘ蛋白，ＡＭＡ－ＳＫ６６是ＳＫ６６的氮端加了２個丙氨酸和１個甲硫氨酸，ＳＫ６６－ｈｉｓ是在ＳＫ６６的碳端加了６個組氨酸；比較ＳＫ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６和Ｔｒｘ－ＳＫ６６殺滅細菌活性，結果表明Ｔｒｘ－ＳＫ６６沒有殺菌活性，ＡＭＡ－ＳＫ６６殺菌活性大大降低。試驗結果說明氮端氨基酸對ＳＫ６６殺菌活性很重要，尤其氮端氨基酸的極性。

關鍵詞：抗菌肽ＳＫ６６；果蠅；富甘氨酸抗菌肽；抗菌機制

中圖分類號：Ｑ７８ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5662-03

昆蟲不具備特異性免疫系統，其利用自身產生的各種昆蟲抗菌肽來應對損傷和感染［１］。昆蟲抗菌肽種類繁多，不同抗菌肽的作用機制不同。根據抗菌肽作用于細胞部位的不同，可以將其大體分為兩類，一類是直接作用于微生物細胞膜的殺傷模式，抗菌肽首先通過靜電結合被吸引到細胞表面，到達質膜后與脂質雙分子層相互作用。目前已提出桶－板模型［１］、毯式模型［２］、環形孔模型［３］等多種模式來解釋抗菌肽的膜穿透活性。另一類為作用于靶點的細胞內殺傷模式?？咕谋晦D入胞漿，能夠通過改變質膜隔膜形成、抑制細胞壁合成、抑制核酸合成、抑制蛋白質合成或抑制酶活性以達到殺菌的目的［４］。

富含甘氨酸（Ｇｌｙ）的抗菌肽的共同特點是一級結構中含甘氨酸，有些是全序中富含甘氨酸［５］，如鞘翅肽（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒｉｃｉｎ）、半翅肽（Ｈｅｍｉｐｔｅｒｉｃｉｎ），有些是某一結構域中富含甘氨酸［６］，如雙翅肽（Ｄｉｐｔｅｒｉｃｉｎ）、麻蠅毒素Ⅱ（ＳａｒｃｏｔｏｘｉｎⅡ）、凝集素（Ａｔｔａｃｉｎ）等，都至少有１個富含甘氨酸的結構域。果蠅抗菌肽ＳＫ６６結構域中富含甘氨酸［７－１０］，試驗通過對ＳＫ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６和Ｔｒｘ－ＳＫ６６的殺菌活性比較，試圖為富甘氨酸抗菌肽ＳＫ６６的抗菌機制研究提供基礎資料。

１ 材料與方法

１．１ 材料

蘇云金芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｇ＋），華中農業大學生命科學與技術學院微生物學實驗室提供；金黃色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，Ｇ＋）、大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｇ－）、枯草桿菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｇ＋）、銅綠假單胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｇ－）由華中科技大學校醫院提供。

ＳＫ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６、Ｔｒｘ－ＳＫ６６為華中科技大學生命科學與技術學院分子生物物理教育部重點實驗室保存。

１．２ 方法

１．２．１ 功能結構域預測 用ＤＮＡｍａｎ和ＧｅｎｅＣａｒｄ軟件進行ＣＧ１３５５１序列分析并進行功能結構域預測。

１．２．２ 最低殺菌濃度（ＭＢＣ）測定 采用微量液體檢測法，參照最低抑菌濃度測定法改進。待測樣品溶于無菌生理鹽水，并作系列二倍稀釋。將培養到對數生長期的待測菌用無菌生理鹽水稀釋，調整菌液為２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ，將此菌液與等體積的抗菌肽樣品溶液混合均勻，對照為無菌生理鹽水。３７℃保溫６０ｍｉｎ后?。处蹋厅c種于空白培養基上，室溫放置３０ｍｉｎ后３７℃倒置培養過夜后觀察。以沒有長出菌落的對應樣品的終濃度為該樣品對該菌的最低殺菌濃度。當對照組長出密集菌落５ｈ后，樣品組只長出少量菌落的則認為該樣品有抑菌能力。

２ 結果與分析

２．１ 富甘氨酸抗菌肽ＳＫ６６氨基酸序列比對和分析

３ 小結與討論

果蠅作為模式生物對研究動物免疫起了重要作用。目前在黑腹果蠅體內已發現了８種抗菌肽，分別為樗蠶素［５］、天蠶素（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ）［６］、防御素（Ｄｅｆｅｎｓｉｎ）［７］、果蠅抗真菌肽（Ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）［５］、果蠅肽（Ｄｏｒｓｏｃｉｎ）［５］、雙翅肽［１１］、碧蝽金屬肽（Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｗｉｎ）［１２］和在雄性果蠅的射精囊中特異表達的Ａｎｄｒｏｐｉｎ［１３］，這些抗菌肽對特定微生物有較強的殺菌作用。

參考文獻：

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［１０］馮志國，郎 君，李燕嬌，等．富甘氨酸果蠅抗菌肽在大腸桿菌中的直接表達和純化［Ｊ］．生物技術通報，２００９（３）：８８－９０．

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［１３］ＤＡＴＥＡ，ＫＡＳＡＨＡＲＡＫ，ＳＡＷＡＩＨ，ｅｔａｌ．Ｒａｐｉｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｒｏｐｉｎｇｅｎｅｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ［Ｊ］．Ｊ ＭｏｌＥｖｏｌ，２００２，５４（５）：６６５－６７０．