萊克多巴胺免疫抗原與多克隆抗體的制備

申宏丹　王記蓮

摘要：采用碳化二亞胺－Ｎ－羥基琥珀酰亞胺（ＥＤＣ－ＮＨＳ）法將萊克多巴胺（ＲＡＣ）與活化的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶聯，合成了免疫抗原（ＲＡＣ－ＢＳＡ），經聚丙烯酰胺凝膠電泳法和紫外吸收法鑒定偶聯成功。用合成的免疫抗原免疫家兔獲得了高效價的多克隆抗體，采用所得抗體和辣根過氧化酶標抗原建立萊克多巴胺直接競爭酶聯免疫吸附分析法（ELISA），標準曲線呈典型Ｓ型，具有良好的線性關系。

關鍵詞：萊克多巴胺；抗原；抗體；酶聯免疫吸附分析法（ELISA）

中圖分類號：Ｓ８５９．８４ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5736-03

萊克多巴胺屬于β２－興奮劑的一種，是一類結構和功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，它可以加快畜禽的生長速度，降低酮體脂肪含量，提高瘦肉率。β２－興奮劑常見的有鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇等。隨著我國對鹽酸克倫特羅監管力度的加大，鹽酸克倫特羅的非法應用得到了有效的控制，萊克多巴胺作為其替代品，非法應用日益猖獗。由于萊克多巴胺在動物組織中殘留可能對人體產生很多不利影響，所以我國農業部、衛生部和國家藥品監督管理局明文禁止萊克多巴胺用于動物養殖［１－４］。關于萊克多巴胺的檢測方法主要有儀器檢測和免疫檢測兩種，免疫檢測法主要包括酶聯免疫法、化學發光免疫法、免疫芯片法以及膠體金層析法［５，６］。質量良好的抗原和抗體是免疫檢測法的基本和關鍵條件。該試驗從改進合成免疫抗原的條件入手，制備了萊克多巴胺多克隆抗體，為以后更好地開發對萊克多巴胺的免疫檢測方法做好了前期探索工作，對保障我國食品安全和醫療安全等具有十分重要的意義。

１ 材料

１．１ 試劑

萊克多巴胺（ＲＡＣ）；自制酶標抗原（ＨＲＰ－ＲＡＣ）；琥珀酸酐；弗氏不完全和完全佐劑；吡啶；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）；卵清蛋白（ＯＶＡ）；甲醇；二氯甲烷；氨水；對乙基－Ｎ，Ｎ－二甲基丙基碳二亞胺（ＥＤＣ）；氮－羥基琥珀酰亞胺（ＮＨＳ）；Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）；乙二胺（ＥＤＡ）；磷酸鹽緩沖液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）。

１．２ 儀器設備

酶標儀（ＤＮＭ－９６０２型，北京普朗新技術有限公司）；旋轉蒸發儀（ＲＥ－５２Ａ型，上海亞榮生化儀器廠）；薄層層析板（GF2541型，青島海洋化工廠）；紫外－可見分光光度計（上海龍尼柯儀器有限公司）；紅外光譜儀（FTS-135型，鞏義市英山谷予華儀器廠）；真空冷凍干燥器（美國Bio-Rad公司）；自動雙重純水蒸餾器（上海申勝生物科技有限公司）；離心機（ＴＧＬ－１６型，上海安亭科學儀器廠）；電泳儀（ＤＹＹ－６Ｃ型，北京六一儀器廠）；電泳槽（ＤＹＣＥ－２４ＥＮ型，北京六一儀器廠）。

２ 方法

２．１ 牛血清白蛋白（ｃＢＳＡ－ＮＨ２）的活化

準確稱取２７ｍｇＥＤＡ溶解于２０ｍＬＰＢＳ中，用ＨＣｌ調節ｐＨ至７．４，制成Ａ液。依次稱取１．５ｇＢＳＡ、８４ｍｇＥＤＣ溶解于２０ｍＬＰＢＳ中，制成Ｂ液。將Ｂ液緩慢加入到Ａ液中，室溫攪拌反應２ｈ，將反應液轉移到半透膜中，４℃用ＰＢＳ透析３ｄ，４～６ｈ換一次透析液，透析完畢，用真空冷凍干燥機凍干，得到白色絮狀固體，－２０℃保存，備用。

２．２ 萊克多巴胺免疫抗原的制備與鑒定

采用改良的ＥＤＣ－ＮＨＳ法［７］合成免疫抗原（ＲＡＣ－ＢＳＡ），稱取３４ｍｇ鹽酸萊克多巴胺和１０ｍｇ琥珀酸酐溶解于２ｍＬ無水吡啶中，在磁力攪拌器下攪拌反應至完全。反應物經旋轉蒸發除去吡啶，用三氯甲烷萃取除去未完全反應的琥珀酸酐，得到純的萊克多巴胺半琥珀酸酐酯（ＲＡＣ－ＨＳ），真空冷凍干燥后得到干態的ＲＡＣ－ＨＳ。將ＲＡＣ－ＨＳ溶解于１ｍＬ１０％ＤＭＦ溶液中，分別加入一定量的ＥＤＣ和ＮＨＳ，室溫避光振蕩活化一段時間，加入β－巰基乙醇淬滅多余的ＥＤＣ。加入一定量活化的ＢＳＡ，室溫反應一段時間后，加入鹽酸羥胺淬滅未反應的ＮＨＳ，透析純化得到偶聯物。采用紫外全波長掃描法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法對免疫抗原的偶聯比進行鑒定。

２．３ 萊克多巴胺多克隆抗體的制備與直接競爭ELISA的建立

初次免疫用注射器對抽法將弗氏完全佐劑與免疫原按1∶1混合成油包水的乳濁液，每只兔注射０．５ｍｇ免疫原，背部皮下多點注射（５～１０點）。兩周后進行二免采用弗氏不完全佐劑，劑量、方法同首免。以后每隔兩周加強免疫一次，劑量減半。從第三次免疫開始，每次免疫７ｄ后，耳緣靜脈采血０．２ｍＬ，室溫凝固２ｈ后４℃過夜，１００００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，分離血清。檢測抗血清效價，陰性兔血清作為對照，當抗血清效價基本不變時，不加佐劑只用生理鹽水進行末次免疫，７ｄ后進行頸動脈采血。血液在４℃靜置過夜，１００００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ，分離上清液，即抗血清。抗血清采用硫酸銨鹽析法初步純化，初步獲得的抗血清再通過ＰｒｏｔｅｉｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ法繼續純化［８，９］，純化抗體冷凍干燥后－２０℃保存。用方陣法確定酶標抗原ＲＡＣ－ＨＲＰ與多抗的最佳工作濃度，建立萊克多巴胺直接競爭酶聯免疫吸附法，操作步驟見文獻［１０］。

３ 結果與分析

３．２ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鑒定免疫抗原結果

電泳遷移率取決于蛋白質分子質量的大小，分子質量越小的蛋白質遷移越快。ＢＳＡ的泳動速度大于ＲＡＣ－ＢＳＡ，說明ＲＡＣ－ＢＳＡ的分子質量大于ＢＳＡ，也可證明ＲＡＣ和ＢＳＡ已成功偶聯。用紫外凝膠成像系統分析軟件計算出ＲＡＣ－ＢＳＡ的分子質量為７．２４×１０４ｕ，ＢＳＡ的分子質量為６．６３×１０４ｕ，計算得出ＢＳＡ與ＲＡＣ的偶聯比約為１∶２０，與紫外鑒定結果的偶聯比基本一致。

３．３ 方陣法確定抗體、酶標物最佳工作濃度

采用常規直接競爭ＥＬＩＳＡ法測定酶標抗原和抗體的最佳工作濃度。用包被緩沖液將抗體從１０００～３２０００倍比稀釋，酶標抗原從１０００～１６０００倍比稀釋，實驗方法見直接競爭ＥＬＩＳＡ反應步驟。以ＯＤ４５０nm為１．０左右時的稀釋度為最佳值，則最佳抗體稀釋度為１∶８０００，最佳酶標物稀釋度為１∶２０００，結果見表２。ＯＤ值≥陰性對照孔２倍判定為陽性，陽性孔的最高稀釋倍數判定為抗體效價，測得抗體效價為１∶16０００，證明所合成的免疫抗原具有免疫活性并且能產生高效價的抗體。

３．４ 直接競爭ＥＬＩＳＡ標準曲線的測定結果

４ 小結與討論

１）ＲＡＣ是小分子物質，只有反應原性沒有免疫原性，必須和大分子載體偶聯后才能免疫動物產生抗體。該試驗中使用的載體蛋白是牛血清白蛋白，先進行活化，用乙二胺（ＥＤＡ）進行封閉，使其只含有氨基，增加牛血清白蛋白和羧基反應的活性，提高了偶聯效率。

２）在ＲＡＣ的仲胺位置成功地連接上琥珀酸酐，引進羧基，可以采用多種常規的人工抗原偶聯方法。該試驗中采用的是在ＥＤＣ基礎上改良的ＥＤＣ－ＮＨＳ法，即在ＥＤＣ基礎上，加入ＮＨＳ，可以控制蛋白質之間的交聯，提高偶聯反應的針對性，達到提高偶聯效率的目的。在合成過程中得到了固態的中間體ＲＡＣ－ＨＳ，為今后的科學研究和工業化生產提供了很大的便利。

３）用合成的免疫抗原免疫大白兔獲得了１∶16０００高效價的多克隆抗體，建立了萊克多巴胺直接競爭酶聯免疫吸附法，用方陣法確定抗體最佳稀釋度為１∶８000，酶標抗原最佳稀釋度為１∶２０００。標準曲線有良好的線性，證明制備的免疫抗原和抗體可用，為繼續深入研究萊克多巴胺的免疫學檢測技術奠定了堅實的基礎。

參考文獻：

［１］ＳＭＩＴＨＤＪ，ＳＨＥＬＶＥＲＷＬ．Ｔｉｓｓｕｅｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆｒａｃｔｏｐｍａｉｎｅａｎｄｕｒｉｎａｒｙｅｘｃｒｅｔｉｏｎｏｆｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎａｎｉｍａｌｓｔｒｅａｔｅｄｆｏｒ７ｄａｙｓｗｉｔｈdietaryｒａｃｔｏｐｍａｉｎｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳcｉｅｎｃｅ，２００２，８０（５）：１２４０－１２４９．

［２］ＲＯＳＳＫＡ，ＢＥＡＵＬＩＥＵＡＤ，ＭＥＲＲＩＬＬＪ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｗｉｔｈｓｐｅｃｉａｌｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｒｏｌｅｏｎｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｌａｎｃｅａｎｄｗａｔｅｒｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｐｏｒｋｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，２０１１，８９（７）：２２４３－２２５６．

［３］張宏偉，王 喆，劉 偉．動物性食品中獸藥和飼料添加劑殘留及其對人體的危害［Ｊ］．獸藥與飼料添加劑，２００４，９（４）：１－３．

［４］張洪才，翁芝瑩，商 璟，等．動物性產品中萊克多巴胺殘留檢測技術研究進展［Ｊ］．食品科學，２０１１，３２（２１）：２５７－２６０．

［５］方耀國，張炳財，鄭志東，等．萊克多巴胺的檢測方法［Ｊ］．畜牧獸醫科技信息，２００９（５）：１２０－１２１．

［６］ＩＮＯＵＥＴ，ＣＨＡＮＧＪＰ．Ｃａｐｉｌｌｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｑｕｎａｔｉｔａｔｉｏｎｏｆｒａｃｔｏｐａｍｉｎｅｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｓｕｓｉｎｇｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓａｓｃｈｉｒａｌａｄｄｉｔｉｖｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｎｒａｌｏｆＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ&ＲｅｌａｔｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２００３，２６（１１）：１６７７－１６９３．

［７］金 晶．ＥＬＩＳＡ法和膠體金免疫層析法檢測豬尿樣中的萊克多巴胺［Ｄ］．南昌：南昌大學，２００７．

［８］于洪俠，楊曙明．萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定［Ｊ］．中國獸醫科技，２００５，３５（１２）：１０００－１００３．

［９］楊利國，胡永褪，魏平華，等．酶免疫測定技術［Ｍ］．南京：南京大學出版社，１９９８．２７９－２８３．

［１０］申宏丹，竇 紅，高春平，等．直接競爭酶聯免疫法檢測萊克多巴胺的研究［Ｊ］．動物醫學進展，２００９，３０（８）：５８－６３．

［１1］朱培坤．免疫酶技術原理和應用［M］．濟南：山東科學技術出版社，２００8．