副豬嗜血桿菌病的防治技術研究

李明波　張抗抗　宋忠旭　梅書棋

摘要：副豬嗜血桿菌病是流行于豬群的接觸性呼吸道傳染病，該病可以影響養豬生產的各個階段，臨床上以豬的纖維素性多發性漿膜炎、心包炎、關節炎、腦膜炎為特征。對副豬嗜血桿菌病的臨床研究應該包括菌株的分離鑒定、血清和基因分型、藥物和疫苗的防治研究等。

關鍵詞：副豬嗜血桿菌??；菌株分離鑒定；分型；免疫及防治

中圖分類號：Ｓ８２８ 文獻標識碼：Ｂ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5730-04

副豬嗜血桿菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）是正常豬群呼吸道上的一種常在菌。臨床上以豬的纖維素性多發性漿膜炎、關節炎、心包炎、腦膜炎為特征，該病又被稱為革拉澤氏病［１］。該病目前在規?；B殖場感染率很高，且危害嚴重，主要引起哺乳仔豬、保育豬（３０～５０日齡）的關節腫脹、喘氣、進行性消瘦、生長速度變緩、急性或慢性死亡等。副豬嗜血桿菌病的臨床發病率一般在１０％～１５％，嚴重時病死率可達５０％，給養豬生產造成嚴重經濟損失。不同血清型菌株之間存在毒力差異。國外特別是養豬發達國家對副豬嗜血桿菌做了流行病學調查，臨床發病豬中分離率高達２０％，且流行的血清型多為副豬嗜血桿菌中毒力較強的４、５、１３型等。蔡旭旺等［２］首次鑒定了副豬嗜血桿菌分離菌株的血清型，進而建立了快速分離鑒定、培養和保存該菌的方法，并篩選出ＴＳＡ（胰蛋白大豆瓊脂）固體培養基和ＴＳＢ液體培養基作為最適合該菌的培養基。同時對２００４年１２月以前分離鑒定的２８１株副豬嗜血桿菌進行了血清分型，表明中國目前流行的菌株是血清４型（２４．２％）和５型（１９．２％），其次是１３型（１２．５％）、１４型（７．１％）和１２型（６．８％），另有１２．１％的分離菌株不能進行血清學分型。

副豬嗜血桿菌病是造成豬場保育豬死亡的主要原因，在特定條件下如斷奶、氣候應激等因素才可侵入機體并引起嚴重的全身性疾病。近年來，由于免疫抑制性疾病如藍耳?。ǎ校遥遥樱A環病毒２型（PCV-2）等的存在和持續性感染加劇了副豬嗜血桿菌的感染程度。

１ 病原學

１９１０年，Ｇｌａｓｓｅｒ首次報道了一種革蘭氏陰性短小桿菌與豬的纖維素性漿膜炎和多發性關節炎之間的聯系。１９２２年，Ｓｃｈｅｒｍｅｒ和Ｅｈｒｌｉｃｈ首次分離出了這種微生物，其分離培養困難。在顯微鏡下觀察，副豬嗜血桿菌短小、無運動、多種形態，從單個的球桿菌到長的、細長的以至絲狀的菌體。通?？梢娗v膜，但體外培養時不受影響。該菌生長只需要Ｖ因子或ＮＡＤ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸），不需要Ｘ因子，屬巴斯德菌科。在鮮血瓊脂平板與葡萄球菌共劃線培養時，呈現典型的“衛星現象”，即越靠近葡萄球菌其生長越好，遠離葡萄球菌的地方不生長，并且在鮮血瓊脂平板上的副豬嗜血桿菌菌落周圍不出現溶血現象。

ＨＰＳ具有莢膜多糖抗原和菌體結構抗原。莢膜多糖抗原成分主要是多糖和磷酸壁，具有型特異性；菌體結構抗原包括外膜蛋白（ＯＭＰ）和脂多糖（ＬＰＳ）。ＨＰＳ已知的毒力因子及潛在的毒力因子主要有莢膜、菌毛、外膜蛋白、ＬＰＳ、轉鐵蛋白、神經氨酸酶等。應用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術可把副豬嗜血桿菌的ＯＭＰ分為兩個完全不同的生物型，即生物１型和生物２型。李靜怡等［３］在ＨＰＳ中發現了２個與流感嗜血桿菌具有同源性的外膜蛋白Ｐ２和Ｐ５，該蛋白與細菌黏附有關，在毒力株和非毒力株中Ｐ２的分子質量分別為４８ｋu和５５ｋu，因此可通過Ｐ２蛋白來區分毒力株和非毒力株。ＨＰＳ的ＯＭＰ具有較好的免疫原性，Ｍｉｎｉａｔｓ等研究發現，用含有ＯＭＰ和ＬＰＳ抗原的菌苗免疫動物，有ＯＭＰ抗體的豬才能抵抗強毒菌株的感染。副豬嗜血桿菌的ＬＰＳ具有與其他革蘭氏陰性菌內毒素相似的活性，而ＬＰＳ可誘導ＰＣＶ-２在體外培養的豬肺泡巨噬細胞中的復制，增加ＰＣＶ-２在細胞核內的抗原和核酸信號［４］。

Ｙｕｅ等［５］以國內分離的優勢血清５型菌株ＳＨ０１６５為親本株完成了全基因組測序，分析鑒定出了２個潛在區分強弱毒力菌株的分子靶標——ＯＭＰ２和ｓｏｄＡ基因。利用８株已測序完成的菌株全基因組序列，總結出１８個主要的毒力相關基因或操縱子基因。全基因組分析結果表明，ＳＨ０１６５菌株的基因組由２２６９１５６個核苷酸組成一個環狀染色體，Ｇ＋Ｃ含量高達３９．９９％，編碼２２９９個基因?；蚪M同源性方面，副豬嗜血桿菌與胸膜肺炎放線桿菌遺傳進化上最接近，分類上獨立于嗜血桿菌屬外形成一個相對獨特的進化分支。

１．１ 血清型分型法

基于免疫擴散試驗的１５種血清型已被確定。型特異性抗原為對熱穩定的多糖，據推測，其可能是莢膜或脂多糖（ＬＰＳ）。副豬嗜血桿菌流行存在明顯地域差異，在日本、德國、澳大利亞、美國、加拿大、西班牙和丹麥分離的血清型中顯示，血清型４、５和１３最為常見。間接血凝（ＩＨＡ）試驗也可用來鑒定副豬嗜血桿菌的血清型，用于彌補免疫擴散試驗分型的局限性，只有６３％的菌株可以通過瓊脂擴散試驗鑒定血清型，相對而言ＩＨＡ可達９０％以上。目前國內建立了基于微量玻片凝集的血清學定型方法（ＮＹ／ＳＹ５４１－２００５），其基本原理是用超波破碎細菌菌體細胞后再與標準血清進行凝集反應。

１．２ 基因分型法

為克服副豬嗜血桿菌血清學分型的局限性，常用基因分型法對其分型，由于不同菌株具有不同的ＤＮＡ指紋圖譜，基因分型主要用于鑒別菌株間的差異，其優點在于敏感性和特異性都較高，可將血清學方法不能分型的細菌進行歸類。常用的基因分型有限制性內切酶指紋圖譜（ＲＥＦ）、多位點酶切電泳（ＭＥＥ）、腸桿菌科基因間重復序列（ＥＲＩＣ－ＰＣＲ）、限制性酶切片段多態性分析（ＲＦＬＰ－ＰＣＲ）等。

目前國內對副豬嗜血桿菌基因分型研究較多的主要是ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法和ＲＦＬＰ－ＰＣＲ法，賈愛卿等［６］應用ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法將廣東地區４８株ＨＰＳ分離株分為３１個基因亞型，歸類為８個群。另３６．１％不能進行血清分型（ＫＲＧ瓊脂擴散法）的菌株也得到充分分型，未發現血清分型與基因分型之間有明顯的相關性，證實ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法比傳統血清分型有更高的識別力，可用于場內及場間病原菌的追溯。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分型法主要針對ＨＰＳ的轉鐵蛋白Ａ（ｔｂｐＡ）基因和ａｒｏＡ基因進行鑒定和分類，通過ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法分析編碼轉鐵結合蛋白基因ｔｂｐＡ對副豬嗜血桿菌進行分型，１５種副豬嗜血桿菌標準菌株可產生１２種不同的圖譜，其中血清型５、１２、１４和１５具有共同的酶切圖譜。ＨＰＳ相同的血清型菌株內具有遺傳多樣性，且血清型與ＲＦＬＰ群之間沒有相關性。李軍星等［７］用基于ｔｂｐＡ基因的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ的分型方法對中國６省市５７株分離菌株及１５個參考菌株進行ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，１５個血清型參考菌株分為９種基因型，５７個流行分離株可分為１５種基因型，其中在中國最為流行的基因型分別為ＤＢＮ（３８％），ＡＢＮ（１８％）與ＤＢＰ（１２％）。目前ＥＲＩＣ－ＰＣＲ和ＲＦＬＰ－ＰＣＲ基因分型法都是建立在菌株分離培養的基礎上。

２ 流行病學

豬是副豬嗜血桿菌的天然宿主，通常可從健康豬的鼻分泌物和氣管黏液中分離出細菌。還可以從患肺炎豬的肺臟中分離出來，正常豬肺臟是分離不出來的。全身組織器官中ＨＰＳ分離率明顯高于呼吸系統組織中的ＨＰＳ分離率，臨床分離ＨＰＳ時應多選擇從全身性組織器官中分離。ＨＰＳ可以影響養豬生產的各個階段，斷奶前后和保育階段發病率較高，高達４０％～５０％?？人?、呼吸困難、消瘦、跛行和背毛粗亂是主要的臨床癥狀。不同血清型菌株毒力存在差異，其中１、５、１０、１２、１３、１４為高毒力菌株；２、４、１５為中等毒力菌株；其他血清型菌株毒力較弱或沒有毒力。

臨床上可依據發病癥狀、剖檢病變和細菌分離鑒定對ＨＰＳ作出常規診斷，進一步可根據１６ＳｒＲＮＡ引物序列建立的ＰＣＲ診斷方法提高檢測病原的靈敏度，擴增的特異性片斷為８２１ｂｐ。該方法檢測的最小細菌濃度為１０２ＣＦＵ／ｍＬ，適合于從全身部位采集的病料［８］。

副豬嗜血桿菌可作為豬呼吸道疾病的病原體，也可作為一種預先影響的因素，引起肺炎的次要或主要病原體。在肺炎中，該菌只在與其他病毒或細菌協同時才引發疾病。這些病原包括支原體、豬藍耳病病毒、豬流感病毒、呼吸道冠狀病毒。ＰＲＲＳV感染的豬群中，有５１．２％的肺臟可分離到副豬嗜血桿菌和豬鼻支原體。目前臨床上ＰＣＶ-２與HPS的混合感染也較為普遍。通常早期斷奶的仔豬在母源抗體不存在的情況下，副豬嗜血桿菌的晚期感染可能會導致嚴重后果。目前在不同群體中混養豬，或引入新種豬，副豬嗜血桿菌的存在是嚴重問題。

３ 免疫與防治

３．１ 疫苗免疫

通過接種商業化疫苗和特異性滅活疫苗可以有效地控制該病的發生。也有使用滅活苗預防失敗的事例，這可能是因為病程中出現的菌株血清型不同或疫苗接種時間控制不當缺乏交叉保護。不同菌株的免疫原性不同并且細菌的毒力可能與其免疫保護力呈正相關［８］。已證實疫苗免疫可以對相同血清型不同菌株的感染產生免疫效力。全菌滅活疫苗主要針對菌株的低脂聚糖產生同種血清型抗體，而菌體蛋白產生的體液抗體能提供高效的免疫保護，在預防ＨＰＳ感染和疾病發生中可發揮重要作用。不同血清型菌株之間的交叉保護沒有一定的相關性。

國內王金合等［９］、宋鳳香等［１０］報道用臨床分離株制備自家疫苗對控制副豬嗜血桿菌有效；Ｍｉｎｉａｔｓ等［１１］比較了ＳＰＦ豬場中商品疫苗和自家疫苗的應用，結果表明臨床分離株的自家疫苗可有效減少該豬場的發病率。對母豬和仔豬的免疫可以防止仔豬發生多發性漿膜炎和關節炎，并且母源抗體并不干擾１周齡和３周齡仔豬的免疫。免疫母豬所產的仔豬很少患肺炎和關節炎，仔豬平均日增重高于非免疫母豬所產的仔豬，也不受額外免疫的影響。蔡旭旺等［２］用國內臨床分離株篩選出高毒力４、５型菌株，制備商品疫苗對母豬及１４日齡仔豬進行免疫后，具有較高的保護率，研究結果還表明母豬抗體對仔豬用滅活疫苗免疫后建立主動免疫反應的過程沒有影響，這與國外研究結果一致。目前國內應用的商品苗免疫失敗的還一個原因可能就是疫苗菌株與臨床典型菌株血清型雖然相同，但兩者基因型卻不同。由于菌株致病力的差異，以及目前對保護性抗原的毒性因子缺乏深入的認識，還不可能產生一種對豬所有的致病菌株同時產生交叉免疫力的滅活苗。

在基因工程疫苗方面，副豬嗜血桿菌的４個蛋白（ＰａｌＡ、ＯＭＰ２、Ｄ１５和ＨＰＳ０６２５７）可用于ＨＰＳ疫苗的候選靶蛋白［１２］。對副豬嗜血桿菌的防控還應加強圓環病毒疫苗（目前主要流行的是ＰＣＶ２ｂ基因亞型）的免疫，特別是免疫斷奶前仔豬（２～４周齡），對提高哺乳期仔豬的成活率、提高生長日增重和整齊度、降低ＰＭＷＳ的發生率和繼發ＨＰＳ感染更有效。

３．２ 藥物治療

抗生素或口服藥物治療對嚴重的副豬嗜血桿菌病暴發效果不大。一旦出現臨床癥狀，應對整個豬群注射大劑量抗生素治療。藥敏及臨床試驗證明大多數菌株對泰拉菌素、頭孢菌素、氨芐青霉素敏感，對氟喹諾酮類、增效磺胺類藥物低度敏感。對副豬嗜血桿菌病的控制方案應當包括免疫疫苗接種和抗菌素處理，但也應當加強飼養管理，如斷奶仔豬飼料中添加支原凈、替米考星、氟苯尼考、多西環素、電解多維、抗病毒中成藥等藥物；減少或根除其他呼吸道病原（多殺性巴氏桿菌、豬肺炎支原體等）；減少豬群流動，降低寒冷、潮濕、閹割等因素造成的應激反應，杜絕生產各階段的混養狀況。

４ 展望

副豬嗜血桿菌病是近年來危害養豬業較大的疾病，其本身的致病機理較為復雜，為尋找對副豬嗜血桿菌病的快速診斷及有效預防和治療方法，國內外學者對其致病機理等方面做了較深入的研究，發現了多種與副豬嗜血桿菌致病性有關的毒力因子。但其血清型眾多，不同血清型的副豬嗜血桿菌毒力差異很大，各毒力因子間的相互作用、毒力因子與疾病的發展關系、以及在新型疫苗研制和協同感染機制方面需做進一步的研究。特別是目前副豬嗜血桿菌常常涉及到與其他傳染性疾病的混合感染，使豬的呼吸道傳染病更為嚴重和復雜，給臨床診斷和防控帶來了很大的困擾。

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