放線菌WS—13661活性產物的快速鑒別

萬中義　張亞妮等

摘要：放線菌ＷＳ－１３６６１的代謝產物對農業病原真菌具有很強的抑制活性。試驗對其ＨＰＬＣ半制備組分進行生物測定，表明其活性部位在１５～２０ｍｉｎ；根據ＨＰＬＣ及ＵＶ圖譜確定其活性成分為五烯類化合物，對其質譜數據進行分析確定了其分子離子峰，經數據庫比對，確定其活性成分為欽氏菌素衍生物。

關鍵詞：放線菌ＷＳ－１３６６１；天然產物；快速鑒別；欽氏菌素

中圖分類號：ＴＱ４６０；Ｒ９１５ 文獻標識碼：A 文章編號：0439－８114（２０12）24－5658-04

放線菌產生的天然產物是生物農藥研究開發的重要來源［１，２］，一方面，放線菌可直接通過發酵產生天然產物制成生物農藥，如阿維菌素［３－５］、多殺菌素［６］、井岡霉素［７，８］等，另一方面，以其天然產物為模板，對天然產物結構進行優化改造，是研發高效低毒綠色農藥的另一途徑，如阿米西達［９］就是以真菌產生的Ｓｔｒｏｂｉｌｕｒｉｎ［１０］為先導化合物經人工改造而獲得的。然而，隨著對環境中放線菌資源的不斷挖掘，重復發現已知化合物的幾率越來越大，獲得新活性化合物的難度越來越大。據湖北省生物農藥工程研究中心統計，從隨機篩選工作中得到新化合物的概率在１％以下，這就說明，９９％以上的活性化合物為已知成分。因此，從大量樣品中快速鑒定活性化合物成為生物農藥篩選的關鍵。

ＷＳ－１３６６１是湖北省生物農藥工程研究中心從湖南省石門地區采集的土樣中分離到的一株放線菌。其發酵提取物經生物測定，對多種農業病原真菌具有較強的抑制活性。經對發酵提取物進行ＨＰＬＣ制備及自動收集，獲得了不同時間流出的樣品共３６份，經生物測定，確定其活性成分在１４～２１ｍｉｎ，經ＨＰＬＣ－ＭＳ分析，結合天然產物數據庫比對，快速鑒定出了活性產物的化學結構。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 菌種 放線菌ＷＳ－１３６６１，分離自湖南省石門地區山地渣土，由湖北省生物農藥工程研究中心保藏。生測用指示菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ、Ｓｅｐｔｏｒｉａｎｏｄｏｒｕｍ，湖北省生物農藥工程研究中心提供。

１．１．２ 培養基 斜面培養基為ＩＳＰ－２瓊脂培養基，１８ｍｍ×１８０ｍｍ玻璃試管每管裝培養基８～１０ｍＬ。種子培養基為ＩＳＰ－２不加瓊脂，５００ｍＬ帶擋板三角瓶每瓶裝培養基１００ｍＬ，１２１℃滅菌３０ｍｉｎ。發酵培養基主要成分為葡萄糖、棉子蛋白、酵母浸粉等，５００ｍＬ帶擋板三角瓶每瓶裝培養基１００ｍＬ，１２１℃滅菌３０ｍｉｎ。

１．１．３ 主要設備 Ｌｙ－０．８型冰凍干燥機，上海東富龍科技有限公司生產；Ｗａｔｅｒｓ高效制備色譜儀（Ｗａｔｅｒｓ２５２５泵、Ｗａｔｅｒｓ２７６７自動收集系統、Ｗａｔｅｒｓ２９９６二極管陣列式檢測器）；Ｗａｔｅｒｓ２６９５高效液相色譜儀（Ｗａｔｅｒｓ２９９６二極管陣列式檢測器）；ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱｕａｔｔｒｏｍｉｃｒｏ質譜儀（電噴霧離子源ＥＳＩ）；ＭａｓｓｌｙｎｘＶ４．１液質聯用分析軟件；查普曼（Ｃｈａｐｍａｎ）天然產物數據庫（２００３版）。

１．２ 方法

１．２．１ 菌株搖瓶發酵 在嚴格無菌條件下從斜面培養基上?。浮保埃恚恚驳囊粔K菌苔轉移至種子培養基搖瓶中，２８℃１５０ｒ／ｍｉｎ振蕩培養７２～９６ｈ，然后按１０％的接種量轉接至發酵培養基中，２８℃，１５０ｒ／ｍｉｎ振蕩培養１００～１２０ｈ，即完成發酵。

１．２．２ 發酵液的凍干及提取 將發酵液轉移至不銹鋼凍干杯中，置凍干機中干燥，凍干條件為－４０℃預凍２ｈ，冷阱預冷至－４５℃以下，開啟真空泵升華（真空度１０～３０Ｐａ，升溫速率２～３℃／ｈ，極限溫升３７℃）。取出凍干粉轉移至三角瓶中，先用少量５０％甲醇濕潤，再加入１００ｍＬ乙酸乙酯，于搖床上１８０ｒ／ｍｉｎ振蕩萃取１ｈ，分離出酯相，旋蒸除去溶劑，再以少量甲醇溶解后送ＨＰＬＣ－ＭＳ分析。

１．２．３ 提取物的生物活性測定 取一定量發酵提取物加入ＤＭＳＯ溶解，以乙醇稀釋至一定濃度后，用９６孔板進行生物測定。組分生物測定采用同樣的生測靶標及方法。

１．２．５ 提取物的鑒別 根據組分生物測定結果確定活性成分的保留時間，從ＨＰＬＣ圖譜中獲得活性物質的紫外吸收光譜，從而確定吸收峰的波長。從ＥＳＩ圖譜中可判定目標產物的分子離子峰。將吸收峰波長及相對分子質量輸入Ｃｈａｐｍａｎ天然產物數據庫，查詢同該物質性質相同或相近的化合物名稱及其化學結構，并進行理化及生物學性質比對，從而確定活性化合物的種類及其化學結構。

２ 結果與分析

２．３ ＷＳ－１３６６１活性產物的質譜分析

２．４ 活性產物的快速鑒定

３ 小結與討論

有機化合物結構的鑒定通常需要四大譜分析，即紅外光譜、紫外光譜、質譜、核磁共振譜，紅外光譜提供了化合物分子振動的信息，紫外光譜則是分子內部電子能級躍遷的結果，質譜提供了分子離子及其碎片的信息，而核磁共振譜則體現了化合物中化學鍵的關系。紅外光譜及核磁共振譜的獲得需要有一定量的純化合物（純度９５％以上，質量２ｍｇ以上），而放線菌活性物質純化合物的獲得需要進行發酵、提取、精制等過程，費時費力，因而采用四大譜聯合進行化合物的鑒定非常耗時，一般鑒定１個化合物需要一至數月。

在微生物源天然產物資源的篩選過程中，篩選得到的絕大多數活性化合物為已知化合物，對每一種活性化合物進行四大譜分析費時費力，而分析結果多數證明是一已知化合物。因此，在篩選過程中進行化合物的早期鑒別非常重要。

多烯類化合物由于其紫外吸收光譜的特殊性，有經驗的科研人員很易識別，而且根據紫外吸收峰的波長很易判斷其共軛雙鍵數目，從而確定其屬于四烯、五烯還是七烯類。

在農用活性化合物的篩選工作中，多烯類化合物由于抗真菌作用強，被篩選到的幾率非常大?；衔锏脑缙诳焖勹b別對提高科研工作效率、降低成本具有重要意義。

參考文獻：

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［２］唐依莉，王 蓉，洪 葵．不同紅樹林地區老鼠簕內生放線菌的分離及其環境適應性［Ｊ］．微生物學通報，２０１２，３９（１）：２５－３２．

［３］沈寅初，楊慧心．殺蟲抗生素Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ的開發及特性［Ｊ］．農藥譯叢，１９９４，１６（３）：１－１３．

［４］殷向東．生物源殺蟲劑研究應用進展及其在我國的發展思路［Ｊ］．農藥，１９９９，３８（１１）：４５－４６．

［５］OＭＵＲＡＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ：４５ｙｅａｒｓｏｆｗａｎｄｅｒｉｎｇ，ｗｏｎｄｅｒｉｎｇａｎｄｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０１１，６７（３５）：６４２０－６４５９．

［６］陳小龍，鄭裕國，沈寅初．農用抗生素刺糖菌素（Ｓｐｉｎｏｓａｄｓ）的研究進展［Ｊ］．農藥，２００２，４１（１）：４－７．

［７］沈寅初．井岡霉素研究開發２５年［Ｊ］．植物保護，１９９６，２２（４）：４４－４５．

［８］沈寅初．我國微生物源殺菌抗生素的研究開發［Ｊ］．世界農藥，２０１１（４）：１－３．

［９］袁武棟．阿米西達——一種獨特的生物殺菌劑［Ｊ］．四川農業科技，２００３（５）：３４．

［１０］ＡＮＫＥ Ｔ，ＯＢＥＲＷＩＮＫＬＥＲＦ．ＴｈｅｓｔｒｏｂｉｌｕｒｉｎｓｎｅｗａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｆｒｏｍｔｈｅＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅＳｔｒｏｂｉｌｕｒｕｓｔｅｎａｃｅｌｌｕｓ［Ｊ］．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９７７，３０（１０）：８０６－８１０．