小麥白粉病離體葉片法生物測定技術研究

張志剛　楊自文　王開梅　張遵霞　張亞妮

摘要：小麥白粉病是由子囊菌亞門真菌小麥白粉病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓ）引起的一種世界性小麥病害。小麥白粉病菌無法在人工培養基上生長繁殖，基于植株的篩選方式難以適用于室內高通量篩選。試驗通過分析小麥白粉病在室內植株上的發病特點，進行了離體葉片人工接種方法的探索，對影響小麥白粉病侵染的主要因素進行了研究，建立了基于離體葉片法和低壓微量噴霧法的高通量篩選方法。利用該方法對２種抗真菌劑進行了室內生物測定試驗，同時對４８０份放線菌液體搖瓶發酵提取物進行了殺菌活性篩選。結果表明，該方法能穩定、高效地進行先導化合物篩選。

關鍵詞：小麥白粉病；人工接種；殺菌活性；葉片法篩選

中圖分類號：Ｑ９３９．９５；Ｓ４３５．１２１．４＋６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5643-03

因為小麥白粉病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓ，原名Ｅｒｙｓｉｐｈｅｇｒａｍｉｎｉｓ）不能在人工培養基上生長和繁殖，針對小麥白粉病的先導化合物篩選只能在植物葉片上進行。離體葉片篩選法具有省時、低消耗、用藥量極少以及重復性好等優點，被作為室內高通量篩選的首選方法。通過實際篩選的檢驗和調整，該篩選模式從靶標培養到數據處理的整個流程已經趨于成熟。

１ 材料與方法

１．１ 試驗材料

１．１．１ 水培法室內培養的小麥葉片 小麥種子浸種１ｄ后播種在裝有營養液的塑料盆中，水培７ｄ后葉片可用于白粉病的傳代培養或切割為離體葉片。水培液配方：尿素５００ｇ、磷酸二氫鉀３００ｇ、硫酸鈣１００ｇ、硫酸鎂５０ｇ、硫酸鋅０．１ｇ、硫酸亞鐵０．３ｇ、硫酸銅０．１ｇ、硫酸錳０．３ｇ、硼酸０．２ｇ、水１０００Ｌ。

１．１．２ 室內培養的小麥白粉病菌孢子粉 水培７ｄ后的小麥葉片進行白粉病菌接種。接種方法為直接將白粉病菌孢子粉抖落到植株上，接種白粉病菌孢子后的小麥苗繼續培養。４ｄ后葉片表面可見點狀的淺色菌斑，再經過３ｄ培養，小麥葉片上便產生大量分生孢子。培養條件：溫度（２０±１）℃，相對濕度４５％～６５％，光照１４ｈ／ｄ，光源為日光燈管組，光照度為３０００ｌｘ，光源距植物頂端３０～３５cm。

１．１．３ 溶劑及標準樣品 溶劑為市售分析純化學試劑甲醇、乙醇、乙酸乙酯；殺菌劑（抗真菌劑）標準樣品為市售分析純化學試劑嘧菌酯、咪鮮胺。

１．１．４ 放線菌液體搖瓶發酵提取物 放線菌液體搖瓶發酵提取物由湖北省生物農藥工程研究中心制備，提取溶劑為乙酸乙酯和甲醇。

１．１．５ 主要儀器和設備 Ｂ１００－１Ｆ蠕動泵、ＨＤ－１３０美術噴筆、ＭＣＥ８ｋ電子移液器、ＤＶ８－２００移液器、人工氣候室（光溫濕可調）、２４孔組織培養板。

１．２ 試驗方法

１．２．１ 葉片處理及不同溫度小麥離體葉片的保鮮試驗 預先在２４孔組織培養板中加入３ｇ／Ｌ熱瓊脂溶液［１］，每孔加入量為１．２ｍＬ，冷卻備用。小麥葉片采下后用打孔器切取長為８ｍｍ的離體葉片（葉切片），葉切片轉入２４孔組織培養板中。葉片背面向上，葉片正面緊貼培養板中已經冷卻的瓊脂。試驗設３個培養溫度（１６、２０、２５℃），比較小麥離體葉片在２４孔組織培養板中的保鮮時間。

１．２．２不同溫度、濕度對小麥白粉病發病影響試驗 采用直接接種小麥白粉病菌孢子的方法進行試驗［２］。試驗設３個培養溫度（１６、２０、２５℃）和２個濕度環境（相對濕度４５％～６５％、１００％），水培７ｄ的小麥苗接種白粉病菌，記錄不同溫度、濕度條件下小麥白粉病發病情況。

１．２．３ 小麥白粉病菌孢子在離體葉片上的侵染試驗 直接將小麥白粉病菌孢子均勻抖落接種在離體葉片上，記錄小麥白粉病在離體葉片上的病情發展［３］。同時以與離體葉片同生長期的水培苗為參照。每組參照用苗２０株，接種時葉片背面向上，并標明有效接種范圍。水培苗葉片與離體葉片同時接種，保證各組葉片接種孢子量相同。接種后的１２塊２４孔組織培養板隨機分為３組在３個不同溫度（１６、２０、２５℃）培養，每個處理４個２４孔組織培養板９６個離體葉片。在光照和濕度相同的不同溫度的培養室進行培養，觀察并記錄小麥白粉病在離體葉片上的病情發展。在菌斑出現后，隨機從各離體葉片組選取２０片（２０段葉切片）離體葉片，統計葉片上病斑數；同時在參照組每株選取１段約８ｍｍ長的葉片，統計葉片上病斑數。培養條件為光照度３０００ｌｘ，相對濕度４５％～６５％。

１．２．４ 抗真菌劑離體葉片法室內生測穩定性試驗［４］ 對２個抗真菌劑標準樣品進行篩選穩定性試驗，按目測分級法進行分級［５］。標準樣品以０．０５０ｍｇ／ｍＬ為最高濃度，二倍法稀釋為１２個梯度濃度。空白對照２組：第一組以乙醇－無菌水（體積比１∶１００）處理，另一組為無菌水處理。試驗分２種方法進行。方法一為預防活性。取１００μｇ樣品溶液進行噴霧，待葉片表面浮水干后接種白粉病菌孢子；方法二為治療活性，先在小麥植株上接種白粉病菌孢子培養４ｄ，葉片上初現淺色菌斑時切取８ｍｍ葉片移入２４孔組織培養板中，葉片背面向上，葉片正面緊貼培養板中已經冷卻的瓊脂，取１００μｇ樣品溶液噴霧后繼續培養１０ｄ檢查，根據每孔病斑數對測定物的殺菌活性進行分級。每個濃度設２個重復。培養條件為溫度（２０±１）℃，相對濕度４５％～６５％，光照時間１４ｈ／ｄ，光照度３０００ｌｘ，光源距２４孔組織培養板５０～６０cm。

１．２．５ 放線菌搖瓶發酵提取物的篩選試驗 取１ｍＬ甲醇加入盛有提取物的樣品管中，待提取物充分溶解后移入預先稱重的１ｍＬ塑料樣品管中，重新干燥后稱重（精確到０．１ｍｇ）。根據樣品量加入溶劑（乙醇，分析純），每毫克樣品加入溶劑量為０．１ｍＬ，超聲波振蕩１０ｍｉｎ后用無菌水稀釋。定容提取物最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬ。樣品設３個梯度濃度，分別為０．０３０、０．０１０、０．００３ｍｇ／ｍＬ，取０．１ｍＬ溶液進行噴霧。待葉片表面浮水干后接種小麥白粉病菌孢子。培養１０ｄ后檢查，根據每孔病斑數對測定物的殺菌活性進行分級。每個濃度設２個重復，僅對２個重復顯示結果不一致的進行復篩。培養條件為溫度（２０±1）℃，相對濕度４５％～６５％，光照時間１４ｈ／ｄ，光照度３０００ｌｘ，光源距組織培養板５０～６０cm。

２ 結果與分析

２．１ 不同溫度小麥離體葉片的保鮮效果

因在２４孔組織培養板中離體葉片用瓊脂保濕并加蓋，在各孔室小環境中濕度能保持在飽和狀態，所以試驗只針對環境溫度進行比較。處理７ｄ和１４ｄ的試驗結果（表１）表明，在１６℃和２０℃溫度下，葉片可以保鮮１４ｄ，綜合溫度對小麥離體葉片和小麥白粉病菌孢子的影響，確定２０℃為篩選適宜溫度。

２．２ 溫度、濕度對小麥白粉病發病的影響

２．３ 不同溫度對侵染的影響

２．４ 抗真菌劑離體葉片法室內生測穩定性

２．５ 放線菌搖瓶發酵提取物離體葉片法篩選結果

隨機選取４８０個放線菌液體搖瓶發酵提取物進行室內離體葉片法篩選，獲得活性提取物１２個。目前篩選工作還在繼續。

３ 討論

小麥白粉病的離體葉片篩選法是在葉片噴霧法的基礎上，經過微型化而形成的一種高通量、高敏感度的室內篩選方法，這種方法適合于產量低、組分多的微生物源先導化合物的篩選。小麥白粉病室內培養及人工接種技術突破了季節、氣候等諸多環境因素的限制，使長年進行有效篩選成為可能。由于離體葉片與大田小麥在生理代謝、生態環境等方面存在差異，對樣品的活性反應差異性有待進一步研究。

參考文獻：

［１］于基成，劉 秋，魏松紅，等．保鮮劑ＭＹ系列在小麥白粉病菌種保存中的應用［Ｊ］．湖北農業科學，２００５，４４（３）：１０１-１０３．

［２］范瑛閣，曹遠銀，魏松紅，等．小麥白粉病潛在生防菌的篩選與控病特性研究［Ｊ］．沈陽農業大學學報，２００５，３６（５）：５４１-５４５．

［３］袁善奎，馬嚴明，周明國．小麥白粉病菌閉囊殼萌發及其對三唑酮敏感基線的建立［Ｊ］．植物保護，２００１，２７（１）：１-３．

［４］李軻軻，司乃國，劉君麗，等.新殺菌劑氯啶菌酯對小麥白粉病的生物活性［Ａ］．中國植物病害化學防治研究第六卷［Ｃ］．北京：中國農業科學技術出版社，２００８．

［５］ＧＢ／Ｔ１７９８０．２２—２０００，農藥田間藥效試驗準則（一）殺菌劑防治禾谷類白粉病［Ｓ］．