轉bar基因小麥大田篩選方法的建立及驗證

張俊成　許甫超等

摘要：為在田間進行有效的陽性小麥轉基因植株的篩選，進行了大田環境中篩選方法的研究。用粉劑和水劑２種不同類型草胺膦作為篩選劑，以無任何遮蓋、地膜覆蓋、簡易小拱棚覆蓋和拱棚覆蓋４種處理，研究其在去除非轉基因植株上的效果差異。結果表明，采用水劑草胺膦比粉劑草胺膦在大田環境中更具有徹底殺滅的效果；４００ｍｇ／Ｌ的粉劑濃度和４００ｍｇ／Ｌ的水劑濃度在覆蓋地膜時均具有較好的篩選效果，粉劑低于該濃度則不能徹底殺滅；從小麥發育的４葉１心期到拔節期均可以作為篩選的時期；比較噴施后殺滅效果，加蓋拱棚＞加蓋簡易小拱棚＞加蓋地膜＞無任何遮蓋，但加蓋拱棚會顯著增加小麥株高；篩選結果與ＰＣＲ檢測結果一致。該研究建立并驗證了一個大田篩選轉ｂａｒ基因小麥的方法，為小麥轉基因材料作為親本用于分子育種奠定了基礎。

關鍵詞：小麥；轉ｂａｒ基因；大田篩選方法；草胺膦

中圖分類號：Ｓ５１２．１；Ｑ７８９ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5592-04

在轉基因小麥研究中，通常在轉化目的基因的同時連接一個選擇標記基因用于對轉基因植株的篩選。據報道，目前已有５０多種標記基因用于轉基因研究，常用的選擇標記基因主要有ｂａｒ基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因［１，２］，其中，ＤＬ－ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ（ＰＰＴ）是轉基因小麥中常用的一種選擇劑，用于篩選含有ｂａｒ基因的轉基因植株。草胺膦抑制植物谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）活性，造成氮代謝失調和必需氨基酸的缺乏，導致植物細胞內氨累積而中毒，而ｂａｒ基因編碼ＰＰＴ乙酰轉移酶（ＰｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎＮ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＰＡＴ），該酶可以使ＰＰＴ乙酰化，從而使ＰＰＴ喪失毒性［３，４］。

以往對轉基因植株的篩選，大多是采用涂抹法或在溫室條件下進行［５－１０］，涂抹法在樣品較少情況下可以較易進行，而對于單株數較多的育種材料來說，則會急劇加大工作量；鑒于溫室條件如光照、溫度、濕度均可控制，在溫室條件下進行噴施或涂抹也較易進行，如果在開放大田環境中用同樣的藥劑、條件和方法篩選轉基因植株，顯然會有較大難度。而進行轉基因分子育種，就必須在田間對較多的后代材料進行選擇，如果不能快速準確地除掉不含目的基因的陰性單株，勢必會大大加重育種人員的負擔。

對于田間進行大規模篩選含有目的基因的方法還鮮有報道。針對該問題進行了小麥大田轉基因植株的篩選研究。根據楊逢玉等［３］影響植物吸收除草劑的關鍵因素是濕度、溫度和光照的研究結果，重點采取了保證溫度和濕度因素的措施，進行了搭建拱棚、簡易小拱棚和覆蓋地膜等對比試驗，并研究了試劑濃度和小麥不同發育時期對除草劑吸收的影響，最終期望摸索出一種徹底、準確殺死非轉基因后代的方法，為將轉基因材料應用于育種奠定堅實的基礎。

１ 材料與方法

１．１ 供試材料

轉高分子麥谷蛋白亞基基因１Ｄｘ５和選擇標記基因ｂａｒ的小麥２－９６１５（５８－１６）和２－９６１７（ｗ１８－１１）由華中科技大學何光源教授提供。非轉基因小麥材料襄麥５５和“９００６８”為華中科技大學生命科學學院實驗室保存。所有材料于２０１１年１１月種植于湖北省農業科學院試驗田，前茬水稻。

篩選劑采用Ｓｉｇｍａ公司草胺膦粉劑和永農生物科技有限公司的草胺膦水劑（有效成分２００ｇ／Ｌ），分別稀釋到１００、１５０、２００、２５０、４００、６００ｍｇ／Ｌ備用。

１．２ 草胺膦噴施方法

處理方法：田間選取長勢良好、整齊的樣地搭建拱棚、簡易拱棚和覆蓋地膜。

噴施時期：從４葉１心期、５葉１心期、６葉１心期至拔節期噴施。

噴施方法：將草胺膦粉劑和水劑稀釋至不同濃度，均勻噴灑在小麥葉片上，直至葉片聚集液滴為止。在晴天正午或當天溫度較高時噴施，有利于對草胺膦的吸收。噴施時使用擋板隔離相鄰的材料。試驗以不噴施草胺膦為對照，以比較除草劑殺滅效果。噴施５ｄ后記錄葉片是否失綠變黃、萎蔫，６０ｄ后查看整個植株是否徹底死亡。

１．３ 驗證方法

ｂａｒ基因ＰＣＲ擴增方法采用張媛媛等［１１］的方法，１．５％瓊脂糖凝膠電泳檢測，引物序列由華大基因合成。

２ 結果與分析

２．１ 不同篩選劑類型對小麥的殺滅效果差異

通過兩種除草劑對比試驗結果可見，在相同濃度下，二者均能使不含ｂａｒ基因的小麥植株產生相應毒害作用，只是粉劑的效果較為短暫，并不能起到完全殺死的作用；而水劑可以完全徹底殺滅非轉基因小麥，效果較明顯。

２．２ 不同處理對不同時期小麥殺滅效果的影響

由于在大田中使用粉劑草胺膦噴施后未采用任何措施以保證噴施后小麥葉片的溫度和濕度，使小麥表現出反應較遲鈍，僅能使個別葉片黃化，之后可以恢復正常。試驗比較了４種處理方式對非轉基因小麥殺滅效果的影響，分別是拱棚（高１．５ｍ）覆蓋、簡易小拱棚（高４０.0ｃｍ）覆蓋、地膜覆蓋和無任何遮蓋處理。

２．２．１ 拱棚遮蓋處理 １２月１８日使用水劑草胺膦處理（１５０、２００、２５０ｍｇ／Ｌ），能夠徹底殺滅非轉基因小麥。噴施后，葉片受毒害反應快，４～５ｄ即能表現出黃化現象，６０ｄ后能夠全部死亡。

２．２．３ 地膜覆蓋處理 １月９日（６葉１心期）用水劑草胺膦２００、４００、６００ｍｇ／Ｌ處理，每個材料各噴施２行，留兩行不噴施做對照，噴施完覆蓋地膜。５ｄ后除２００ｍｇ／Ｌ濃度略有綠色外，其余濃度處理葉片均變黃，６０ｄ后２００ｍｇ／Ｌ濃度處理仍有幾株小麥存活，而其余濃度處理小麥均全部死亡。說明４００ｍｇ／Ｌ或以上濃度在加蓋地膜情況下，可以徹底殺滅非轉基因小麥植株。

２．３ 大田直接噴施結果

為了探索不做任何遮蓋處理噴施水劑草胺膦對非轉基因小麥的殺滅效果，使用４００ｍｇ／Ｌ濃度噴施非轉基因材料后，50%采取覆蓋地膜處理，50%不做任何處理。結果覆蓋了地膜的小麥全部死亡，未做任何處理的小麥大部分也全部死亡，但是反應時間較覆蓋地膜的小麥遲。

２．４ 不同處理對小麥生長發育的影響

２．５ 超大劑量噴施草胺膦對轉基因小麥的影響

為了考查過量使用除草劑對轉基因植株鑒定的影響，試驗采用正常使用劑量的６.0倍和７．５倍處理含有ｂａｒ基因的小麥材料２－９６１５和２－９６１７。結果表明，噴施后植株基部老葉葉尖逐漸變黃，最終基部約３片葉死亡，但整個植株未受大的影響，仍能正常生長，２０ｄ后即轉為正常狀態。說明若過量施用了草胺膦，也不能殺死攜帶目標基因的植株，從而不會影響后代選擇。

２．６ 篩選方法的驗證

３ 討論

３．１ 最優處理方式的確定

大田環境中溫度、濕度和光照隨天氣變化而變化，不利于植物對除草劑的吸收，從而影響了殺滅陰性材料的效果［３］。為確保對陽性植株的選擇，在噴施除草劑后加蓋透明的覆蓋物，以達到保溫和保濕的目的。結果表明，加蓋的拱棚的高度越高，植株對除草劑的反應越快，但同時對植株的株高影響也越大。只有覆蓋地膜對植株高度無影響，同樣能夠達到較好的選擇效果，同時覆蓋地膜的方法簡單易行，所用成本也較低，又能確保徹底殺滅陰性植株，因此建議采用噴施草胺膦后覆蓋地膜而無需搭建拱棚。此外，水劑草胺膦殺滅效果顯著優于粉劑草胺膦，而且成本也非常低。

３．２ 不同基因型和發育時期對草胺膦吸收的影響

就基因型而言，研究采用非轉基因小麥材料和轉基因材料各兩個，噴施前期的反應略有差異，如葉色黃化程度，與武麗敏等［１２］的結果一致，但到后期基本無較大變化。因此，非轉基因小麥和轉基因小麥的不同基因型對除草劑的適用性沒有較大影響。就葉齡或發育時期而言，從４葉１心期到拔節期均進行了不同濃度的試驗，并未發現對草胺膦反應遲鈍時期，說明這些時期均可進行草胺膦篩選試驗。值得注意的是，拔節期后植株株高明顯增高，不利于覆蓋地膜，建議最好在拔節期前進行噴施。

參考文獻：

［１］ＭＩＫＩＢ，ＭＣＨＵＧＨＳ．Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓａｎｄｂｉｏｓａｆｅｔｙ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１０７：１９３－２３２．

［２］歐巧明，陳玉梁，張正英，等．小麥轉基因技術研究進展及其在育種中的應用［Ｊ］．中國農學通報，２００５，２１（１）：４１－４５．

［３］楊逢玉，張宏軍，倪漢文．滅生性除草劑草胺膦的作用機理及其應用［Ｊ］．北京農學院學報，２００２，１７（４）：１００－１０５．

［４］周淼平，余桂紅，任麗娟，等．轉抗除草劑基因小麥植株的篩選方法研究［Ｊ］．麥類作物學報，２００８，２８（６）：９３５－９４０．

［５］朱常香，宋云枝，張杰道，等．抗蟲、抗除草劑轉基因玉米的獲得及遺傳研究［Ｊ］．山東農業大學學報（自然科學版），２００２，３３（２）：１２０－１２５．

［６］王才林，趙 凌，宗壽余，等．用花粉管通道法將ｂａｒ基因導入水稻獲得可遺傳的轉基因植株［Ｊ］．江蘇農業科學，２００２，１８（３）：１２９－１３３．

［７］姚方印，李中華，李廣賢．根據標記基因快速檢測轉基因水稻［Ｊ］．山東農業科學，２００１（３）：１９－２０．

［８］伍成祥，宛煜嵩，徐 俊，等．基因槍轉化ＭＡＲ序列介導水稻ｂａｒ基因的表達分析［Ｊ］．生物技術學報，２００２，１０（３）：２２７－２３０．

［９］王才林，趙 凌，宗壽余，等．水稻抗除草劑基因ｂａｒ的轉育研究［Ｊ］．作物學報，２００２，２８（３）：３０５－３０９．

［１０］徐瓊芳，李連城，陳 孝，等．基因槍法獲得ＧＮＡ轉基因小麥植株的研究［Ｊ］．中國農業科學，２００１，３４（１）：５－８．

［１１］張媛媛，江昌俊，蔣明權．用基因槍法將抗除草劑ｂａｒ基因導入小麥的研究［Ｊ］．南京農業大學學報，２００５，２８（１）：１１－１５．

［１２］武麗敏，魏育明，鄭有良．不同基因型小麥對除草劑Ｂａｓｔａ敏感性研究［Ｊ］．麥類作物學報，２００４，２４（２）：１１８－１２０．